Staphylococcus aureus: Cocos gram-positivos

Técnica de Gram

Staphylococcus aureus: Cocos gram-positivos

A técnica de Gram ou coloração de Gram é uma técnica de coloração de preparações histológicas para observação ao microscópio óptico, utilizada para corar diferencialmente microorganismos com base na composição química e integridade da sua parede celular. Consoante a cor que adquirem, são classificados em gram positivos (roxo) ou gram negativos (vermelho). Tal método se deve ao médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853-1938). Geralmente as bactérias "gram negativas" são mais patogénicas, possuindo ainda lipopolissacarídeos na sua membrana exterior, que agravam a infecção.

Na técnica de Gram, colora-se bactérias com um corante violeta especial. A bactéria que assim obtiver uma cor roxa, será gram positiva e a que obtiver coloração rósea, gram negativa. A gram positiva ganha coloração roxa porque sua camada mais externa, a parede celular, formada por peptidoglicano, absorve a tinta. Já a gram negativa é rósea porque, apesar de também ter parede celular, esta fica fica abaixo de uma membrana adicional, parecida com a mebrana plasmática, típica deste grupo de bactérias, logo não ocorrendo absorção.

Procedimento

Confeccionar o esfregaço;

Corar com violeta de cristal por 60 segundos;

Lavar com esguicho de água destilada;

Cubrir com Iodo de Gram ou Lugol por 60 segundos;

Lavar com esguicho de água destilada;

Descorar com álcool a 95%, ou acetona, 10-20 segundos;

Lavar com esguicho de água destilada;

Corar com safranina por 20 segundos

Lavar com água destilada, secar e observar ao microscópio.

Resultados: Gram (+) coram de roxo, gram (-) coram de rosa

Pseudomonas aeruginosa: Bacilos gram-negativos

As características estruturais da parede bacteriana estão na base da técnica de Gram que funciona da seguinte forma.

O primeiro corante (cristal-de-metila) penetra na bactéria assim como o mordente (Soluto de Lugol). Intracelularmente forma-se um complexo corante-iodo, insolúvel em água, que vai corar o protoplasma e a parede celular. A camada de peptidoglicano é maior em bactérias gram positivas, as gram negativas, por sua vez possuem pouco peptidoglicano e são coradas pelo vermelho de safranina.

A lavagem com alcool 99,5º GL dissolve o complexo corante-iodo, e a se a parede celular for permeável a este, arrasta-o para fora da célula. As bactérias capazes de preservar a coloração roxa do 1º corante, o violeta de Genciana, designam-se por Gram positivas. As bactérias que, após a lavagem com álcool-acetona, são incapazes de reter o violeta de Genciana, designam-se por Gram negativas, corando pela fucsina diluída que se fixa apenas nas bactérias Gram-negativas. Resumindo, as bactérias Gram positivas coram de roxo e as Gram negativas coram de vermelho. Esta técnica de coloração permite então a distinção entre bactérias com parede celular mais ou menos rica em peptidoglicanos. De referir que embora uma bactéria Gram negativa nunca possa corar positivamente pelo Gram, uma bactéria estruturalmente Gram positiva pode corar negativamente se a sua parede de peptidoglicano for destruída ou danificada (ex. envelhecimento celular ou acção de lisozimas).

Preparação para a coloração

Na observação microscópica pós coloração o material a observar deve ser previamente fixado, o que facilita a observação de bactérias, uma vez que têm reduzidas dimensões, fraco contraste e algumas refringência e mobilidade.

A fixação é a coagulação do protoplasma bacteriano com o mínimo de deformação e sua colagem à lâmina. Como exemplos de agentes fixadores temos o calor, o formol e o éter.

A coloração recorre do uso de corantes e permite aumentar o contraste e evidenciar a estrutura bacteriana. Estes são compostos orgânicos, com um ou mais anéis benzênicos que se encontram ligados a dois grupos funcionais, o cromóforo que é responsável pela cor do corante e o auxócromo que se dissocia ionicamente em solução dotando o corante de capacidade para reagir com os tecidos, células e estruturas celulares. Podemos diferenciar dois tipos de corantes: os corantes ácidos (são negativos, formando sais com cátions) e os corantes básicos (são positivos, formando sais com ânions). Como as bactérias possuem carga eléctrica negativa, existe afinidade entre os corantes básicos e as estruturas celulares da bactéria, permitindo que esta fique corada. Para reforçar a ação do corante, aumentando a força de ligação deste, as estruturas celulares utilizam-se de mordentes como o ácido tânico, o ácido crômico, o ácido fênico, o iodo (Soluto de Lugol), o calor e os álcalis. Os solutos corantes são compostos de várias substâncias, sendo geralmente hidro-alcoólicos-fenicados porque, além da substância corante, possuem água para permitir a dissociação iônica do corante; álcool para conservar e ácido fênico, que atua como mordente e como bacteriostático, evitando a contaminação das soluções corantes. Após a aplicação do corante, aplica-se um diferenciador, que serve para retirar o excesso de corante (acetona, ácido sulfúrico, álcool 95º). Os diferenciadores têm a capacidade de descorar certas bactérias já previamente coradas e são usados em colorações policromáticas. A preparação de colorações policromáticas segue um protocolo constante. Assim, sobre um esfregaço (células fixadas pelo calor), aplica-se:

O primeiro corante

O mordente

O diferenciador

Água (vai parar a diferenciação)

Segundo