A METODOLOGIAS LABORATORIAIS APLICADAS À BIOLOGIA CELULAR

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E ESTRUTURAL APLICADAS

AULA PRÁTICA:

DOSAGEM DE PROTEÍNAS – MÉTODO DE BRADFORD

LAYS OLIVEIRA ROCHA

METODOLOGIAS LABORATORIAIS APLICADAS À BIOLOGIA CELULAR

29 de novembro de 2017

Profa. Dra. Daniele Lisboa Ribeiro

Introdução:

O método proposto por Marion Bradford em 1976 é baseado na adsorção do reagente Coomassie Brilliant Blue G-250. Esse é um método realizado para a quantificação de proteínas, uma vez que atividades de pesquisa e desenvolvimento na área de produção, purificação e caracterização de enzimas exigem um método que seja rápido e sensível que possa quantificar as proteínas. O reagente de Bradford contém como seu principal componente o corante Coomassie Brilliant Blue G-250 em solução ácida, este ao ligar-se às proteínas, tem a sua absorbância alterada de 465nm para 595nm. Esta interação entre o corante Coomassie com a proteína, estabiliza a forma aniônica do corante, causando uma visível mudança de coloração inicialmente castanho para tons de azul, de acordo com a concentração da proteína.             A absorbância pode ser medida em um espectrofotômetro ou leitor de microplacas utilizando o comprimento de onda de 595nm. A comparação dos resultados com uma curva padrão, com valores de concentrações conhecidos, permite a determinação da concentração da proteína em estudo. Na aula prática realizada no dia 29 de novembro, fizemos o preparo de uma curva de calibração para a quantificação de proteínas pelo método de Bradford, usando a albumina como padrão.  

Objetivos:

Utilizar um método espectrofotômetro de quantificação de proteínas, determinar a concentração de proteína em uma amostra de extrato de próstata através do método de Bradford.

Materiais utilizados:

 Para a preparação do reagente de Bradford, dissolveu-se 100mg de Coomassie Brilliant Blue G-250 em 50mL de etanol 95% e, em seguida, adicionou-se 100mL de ácido fosfórico. A solução foi completada com 1 litro de água destilada. Após filtração em papel de filtro quantitativo, a solução foi mantida em geladeira.

As soluções padrão foram preparadas em duplicatas em tubos de ensaio. Realizar em duplicata nos confere mais segurança, uma vez que vários agentes podem interferir e depois se realizou uma média entre os resultados.

Procedimentos:

Preparo da curva padrão:

Foi distribuído em uma estante, 12 tubos de ensaio, numerados de 1 a 6 em duplicatas. Utilizando as micropipetas de acordo com o volume pretendido, foi adicionado água destilada, albumina na quantidade padrão e o reagente de Bradford, de modo que a quantidade final da amostra deverá ser sempre 50µl. Para essa amostra, fizemos uma diluição de 5x, ou seja, pegamos 5µl da amostra e 45µl de água destilada e para cada 50µl de amostra foi adicionado 1,5µl do Reagente de Bradford.

CONCENTRAÇÃO	ALBUMINA – 2mg/ml	ÁGUA
1 mg/ml	25µl	25 µl
0,75 mg/ml	18,75 µl	31,25 µl
0,5 mg/ml	12,5 µl	37,5 µl
0,25 mg/ml	6,25 µl	43,75 µl
0 mg/ml	0	50 µl

Então, antes da leitura, fizemos uma calibração no espectrofotômetro para avaliar a resposta do equipamento em comprimentos de onda estabelecidos por norma em unidade de absorbância ou transmitância. Para este processo colocamos água na cubeta para realizar uma leitura em branco, depois em transmitância com um fundo preto, em seguida realizou as leituras dos padrões de albumina e depois as amostras.