Soluções MBT MALDI

Preparo de Soluções MBT

Introdução: o MBT utiliza várias soluções de ácidos orgânicos para: 1) preparer o Bacterial Standard (BTS) e HCCA (Matriz); 2) completer a extração com ácido fórmico; e 3) limpar a target plate. Esse document foi criado para assisti-lo no preparo das soluções iniciais e não tem a intenção de substituir as instruções de uso e procedimentos  das instruções de uso dos produtos. Por favor, reveja este documento até que um bom nível de confiança seja estabelecido. Os volumes sugeridos abaixo são exemplos somente e podem ser ajustados segundo o volume de rotina do laboratório.

Materiais:

1. Capela Química
2. Etanol 100% (HPLC/MS grade)
3. Ácido Fórmico 100% (HPLC/MS grade)
4. Acetonitrile 100% (HPLC/MS grade)
5. Ácido Trifluoracético 100% (HPLC/MS grade)    
6. Água (HPLC/MS grade)
7. Luvas Chemical-Safe
8. Pipetas volumétrica de vidro (se disponível); podem substituir as pipetas Eppendorf
9. (2) Frascos de vidro âmbar 10 – 50 mL com tampa Chemical-Safe
10. (4) tubos de centrifigação Eppendorf 50 mL e suporte (ou frascos de vidro)
11. (2) Squeeze de plastic (para o álcool 70% e água)

 NOTA: Ácido Trifluoroacético é muito corrosive; Acetonitrila é altamente inflamável.

Preparo do Solvente Orgânico: deve ser preparado dentro da capela química e utilizer luvas chemical-safe; usado para reconstituir o BTS e o HCCA. É MUITO IMPORTANTE que este reagent seja preparado  com medidas exatas e com muito cuidado!!!; armazene em temperature ambiente; sempre deixar a tampa no frasco visto que Acetonitrila é muito volatile e a evaporação impactará negativamente na concentração do solvent; sempre adiciona água ao frasco primeiro e depois adicione Ácido Trifluoracético e Acetonitrila.

Para preparar 1 mL da solução em 1 tubo  Eppendorf 1,5 mL:

475  µL  Água HPLC/MS grade +  25 µL Ácido Trifluoracético 100% HPLC/MS grade (TFA) + 500 µL Acetonitrile 100% HPLC/MS grade (AN) = 1 mL de Solvente Orgânico

Soluções para fazer Extração com Ác. Fórmico: o processo de extração com ác. Fórmico é usado para quebrar a espessa parede celular de maneira que as proteínas posam ser liberadas, ação fundamental para a coleta do espectro. Quatro soluções devem ser preparadas: 1) ác. Fórmico 70%; 2) Acetonitrila 100%; 3) Etanol 100%; e 4) Água HPLC/MS Grade.  

1. Ác. Fórmico 70%: prepare em capela para substâncias químicas e use luvas próprias; prepare em frasco apropiado; verifique as condições de armazenamento com o fornecedor; adicione sempre água antes do ácido fórmico.

3 mL de água (HPLC/MS grade) + 7 mL de ác. Fórmico 100% = 10 mL de ác. Fórmico 70%

1. Acetonitrila 100%: prepare em capela para substâncias químicas e use luvas próprias; colocar aproximadamente 10 mL de acetonitrile 100% em frasco apropiado; verifique as condições de armazenamento; deve sempre manter a tampa para prevenir evaporação; nunca use o frasco original para preparar amostras.
2. Etanol 100%: colocar aproximadamente 50 mL  de etanol 100% em tubo de centrífuga plástico (marca Eppendorf ou BD) ou frasco de vidro; armazenar em temperatura ambiente; nunca use o frasco original para preparar amostras.
3. Água (HPLC/MS grade): colocar aproximadamente 50 mL  de etanol 100% em tubo de centrífuga plástico (marca Eppendorf ou BD) ou frasco de vidro; armazenar em temperatura ambiente; substituir imediatamente se a água parecer turva.

Limpeza da Target Plate: a medida que a target vai sendo usada (seus poços utilizados) se torna necessário fazer a sua limpeza com 1) Etanol 70% e 2) Ác. Trifluoroacético 80%.

1. Para preparar 1 L de solução de limpeza Etanol 100%: prepara em frasco de plástico tipo “squeeze”:

300 mL de água purificada/filtrada + 700 mL de Etanol 100% = 1 L de Etanol 70%

1. Para preparar 2 mL de Ác. Trifluoroacético 80%; prepare em capela para substâncias químicas e use luvas próprias; preparar em frasco apropiado; armazenar em temperatura ambiente:

0,4 mL de água purificada/filtrada + 1,6 mL de Ác. Trifluoracético 100% = 2 mL de Ác. Trifluoroacético 80%