A Inibição e redução de Sphk1 diminuíram a neuro inflamação MCAO

Artigo: Sphingosine kinase 1 mediates neuroinflammation following cerebral ischemia

Esfingosina quinase tipo 1 medeia a neuroinflamação após isquemia cerebral

Resultados:

Sphk1 mas não/but not Sphk2 foi induzida por insultos isquêmicos patológicos

A mortalidade de camundongos após MCAO foi relatada na Tabela 1. Não houve diferença na mortalidade entre os grupos de tratamento. Dentro do nosso estudo, 1 h de MCAO resultou em danos significativos no infarto nos camundongos. Comparado com o ARNm de Sphk1 na região não isquêmica, contralateral córtex ou que no córtex dos ratinhos operados simuladamente, mRNA de Sphk1 em a penumbra cortical foi significativamente aumentada por 1 h de MCAO, e este aumento começou às 6 h e persistiu até 96 h após a reperfusão (Figura 1A). Curiosamente , os níveis de mRNA de Sphk2 não foram alterados na penumbra cortical após 1 h de MCAO (Fig. 1B). O western blot mostrou ainda a indução da proteína Sphk1 na penumbra cortical a seguir ao MCAO (Fig. 1C). Resultados imuno-histoquímicos revelaram que o sinal Sphk1 (vermelho) foi amplamente co-localizado com o marcador microglial Iba1 e o marcador neuronal NeuN na penumbra cortical às 24 h após a reperfusão (Fig. 1D), sugerindo que a microglia e os neurônios eram as principais fontes celulares Responsável pela indução de Sphk1 após isquemia cerebral.

A inibição de Sphk1 reduziu os volumes de infarto e melhorou os resultados comportamentais

Para investigar o papel de Sphk1 após isquemia cerebral, examinamos os efeitos do inibidor Sphk1 5C sobre os volumes de infarto e os resultados comportamentais aos 24 e 96 h após a reperfusão utilizando o modelo MCAO de murganho. Para assegurar que insultos isquêmicos comparáveis foram induzidos em camundongos, utilizou-se Doppler laser para monitorar a diminuição da perfusão cortical aos 5 min após MCAO. A diminuição da perfusão cortical, expressa como% de linha de base, não foi diferente entre o veículo e o grupo de injeção 5C (veículo vs grupo de injeção 5C: 12,3 ± 0,6% vs. 11,6 ± 0,5% para a análise do infarto 24 h após a reperfusão , E 12,0 ± 0,7% vs. 12,0 ± 0,8% para (infarto e análise comportamental às 96 h após a reperfusão).

Em comparação com o veículo, as injecções diárias de 5C iniciadas 3 horas após a reperfusão reduziram os volumes de infarto a 24 h (Figuras 2A e B) e 96 h após a reperfusão (Fig. 2C). Além disso, a inibição pós-isquêmica de Sphk1 com 5C melhorou os resultados comportamentais a 96 h após MCAO (Fig. 2D). Nós ainda usamos a abordagem knockdown siRNA para investigar o papel de Sphk1 na isquemia cerebral. A injeção intracerebroventricula0072 de siRNAs foi relatada para diminuir a expressão do gene alvo na penumbra cortical no modelo MCAO de rato (Hayakawa et al., 2012). Utilizamos esta estratégia para bloquear a indução pós-isquêmica de Sphk1 na penumbra cortical. Foi administrado siRNA de sentido n� (NS) ou ARNip de Sphk1 via ICV 2 dias antes da MCAO. Como esperado, em comparação com o siRNA de nonsense/absurdo (NS), o siRNA de Sphk1 atenuou eficazmente a indução isquêmica de mRNA de Sphk1 e proteína na penumbra cortical às 24 h após MCAO (Figuras 3A e B). Os ratinhos injetados com siRNA de Sphk1 apresentaram infartos corticais que eram menores do que os dos ratinhos injetados com siRNA de NS a 24 após a reperfusão (Figuras 3C e D). Além disso, a diminuição na perfusão cortical, expressa como% de linha de base, não foi diferente entre o grupo de injeção de siRNA de scramble e Sphk1 (11,2 ± 0,4% vs. 11,6 ± 0,5%).

A inibição e redução de Sphk1 diminuíram a neuroinflamação MCAO

A neuroinflamação contribui para a patogênese do acidente vascular cerebral (An et al., 2014, Leak et al., 2014, Zhou et al., 2014). Como Sphk1 foi relatado para desempenhar papéis essenciais na regulação da inflamação (van Leyen et al., 2005) e porque descobrimos que microglia foram as principais fontes celulares de Sphk1 indução após MCAO, investigamos se Sphk1 medeia a neuroinflamação pós AVC. Para o efeito, realizou-se qPCR para determinar se se a inibição de Sphk1 ou knockdown suprimiu a expressão de mediadores pró-inflamatórios no cérebro isquêmico após MCAO. Às 24 h após MCAO, os níveis de mRNA de IL-1β, iNOS, IL-6 e TNF-α aumentaram significativamente no córtex isquêmico em comparação com o córtex contralateral e os córtices dos ratinhos operados simuladamente. Em comparação com o veículo e o NS de siRNA, a 5C inibidor SPHK1 e SPHK1 siRNA atenuou significativamente a indução isquêmica destes mediadores pró-inflamatórios (Fig. 4).

MCAO intensificou a atividade de Esfingosina quinase no cóterx ipsilateral, que foi atenuada por desmontagem ou inibição de Esfingosina quinase 1

Para investigar se a expressão induzida por MCAO de Sphk1 resultou em atividade de Sphk aumentada e se Sphk1 e 5C atenuaram a indução pós-isquêmica da atividade de Sphk no cérebro isquêmico, medimos a atividade de Sphk às 6 h após a reperfusão a seguir ao MCAO. Escolhemos este ponto de tempo inicial com base na nossa observação de que a expressão de Sphk1 foi induzida tão cedo quanto 6 h após a reperfusão (Fig. 1). Além disso, se a atividade de Sphk1 contribuiu para a evolução do infarto e a neuroinflamação aumentada às 24 h após a reperfusão, pensamos que o aumento da atividade deve ocorrer antes do tempo de 24 h. Consistente com os resultados relativamente à expressão de Sphk1, observou-se que a atividade de Sphk foi significativamente aumentada na penumbra cortical em comparação com o córtex contralateral e os córtices dos ratinhos operados simuladamente (Fig. 5). Além disso, em comparação com o siRNA de NS e o veículo, o siRNA de Sphk1 injectado 2 dias antes da MCAO e a administração de 5C 3 h após reperfusão atenuou significativamente a atividade de Sphk induzida por isquemia na penumbra cortical 6 h após reperfusão.

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