Trypan Blue Exclusion Assay By Flow Cytometry

Trypan blue exclusion assay by flow cytometry

Ensaio de exclusão de azul de trypan por citometria de fluxo

Introdução

Análise de viabilidade celular é uma ferramenta útil em vários procedimentos experimentais, incluindo os de susceptibilidade tumor, resistência microbiológica, e morte celular espontânea após a apresentação de diferentes condições experimentais (1-4). Tem sido demonstrado que a integridade da membrana celular é um critério básico para distinguir mortos a partir de células vivas (5). Assim, corantes capazes de penetrar seletivamente o citoplasma das células mortas têm sido amplamente utilizadas como corantes vitais. O método de azul de tripano (TB) é um ensaio muito comum para avaliar a citotoxicidade em investigações experimentais (6-8), onde as células mortas absorver TB para o citoplasma por causa da perda de selectividade da membrana, enquanto que as células permanecem vivos não coradas (6). Assim, o número relativo de células mortas e vivas é obtida por microscopia óptica através da contagem do número de coradas (mortos) e células não-coradas (vivo), utilizando uma câmara de Neubauer. Este ensaio de exclusão de TB convencional, quando usado por um grande número de amostras, pode proporcionar resultados de baixa precisão, devido ao longo tempo de execução e o exame microscópico intensiva necessária (9).

Estudos anteriores demonstraram que os complexos de proteína-TB emitem fluorescência. Como demonstrado por Harrisson et al. (10), a TB injectada subcutaneamente em codornizes japonesas foi adsorvido em gema exógeno, e os locais de ligação em oócitos foram visualizadas por microscopia de fluorescência. Além disso, Kumar et al. (11) sugeriram que a TB é um corante adequado para a detecção de esporos de micorrizas arbusculares por microscopia de fluorescência confocal. Este protocolo utilizado um comprimento de onda de excitação de 488 nm, com emissão a partir de 585 nm. Apesar de TB. tem a capacidade de emitir fluorescência quando complexada com proteínas, poucos estudos têm sido realizados para melhorar o teste de exclusão TB, fazendo as adaptações necessárias para a análise de citometria de fluxo. Até à data, coloração com iodeto de propídio (PI), seguido de análise de citometria de fluxo é um dos ensaios mais amplamente estabelecidos para avaliação da viabilidade (12,13). Semelhante a TB, PI tem a capacidade de penetrar nas células mortas e para complexar com DNA (14-16). Propomos um teste de exclusão com TB utilizando citometria de fluxo como uma alternativa, barato e viável técnica para ser utilizado em conjunto com a análise de fenótipo, sem interferência com a viabilidade celular e nenhuma têmpera de fluorescência verde, como foi previamente relatada (17).

MÉTODOS

As células mononucleares do sangue periférico (PBMC)

Uma amostra de sangue venoso (cerca de 10 ml) a partir de 7 dadores saudáveis (22 ± 2,0 anos de idade) foi recolhido em tubos heparinizados 6 h antes da experiência. A coleta de sangue foi realizada 07:30-8h30 seguindo estes de desenho de sangue critérios rigorosos: infecção não informou ou sintomas de infecção por 7 dias antes de tomar a amostra, sujeito relatou sono adequado

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