A Solubilização de Proteínas

Introdução:

Existem diversos fatores que afetam a solubilidade e a precipitação das proteínas, entre eles está a adição de sais, que provocam o fenômeno de salting in (quando a proteína tem sua solubilidade aumentada em decorrência da adição de sal) e também o fenômeno de salting out (quando a proteína tem sua solubilidade reduzida em função da adição de sal e precipita).

Além disso, a presença de cargas elétricas nas proteínas é relevante na sua solubilidade e precipitação. Quando a proteína se encontra em meio ácido (Carga positiva), abaixo do seu ponto isoelétrico, há aumento da solubilidade em água e leva a precipitação e desnaturação da proteína. Quando ela está em meio alcalino (Carga negativa), acima do seu ponto isoelétrico, há diminuição da solubilidade em agua e acontece a formação de precipitados insolúveis. No momento em que ela se encontra no ponto isoelétrico, ocorre precipitação, pois ela não solubiliza em função de que, nesse meio, a repulsão entre as moléculas é diminuída e favorece a agregação e a precipitação.

Entre outros fatores que modificam a solubilidade e afetam a desorganização das proteínas está o calor, que provoca a desorganização das cadeias peptídicas das proteínas, muda a conformação delas e alteram propriedades como as físico-químicas, porém não afeta as ligações peptídicas. Isso envolve o processo de desnaturação das proteínas, que as tornam insolúveis em solventes que, antes, elas eram solúveis e, em decorrência disso, há precipitação (máxima no pI).

Os experimentos têm como objetivo a visualização dos fenômenos que ocorrem com as proteínas. No experimento nº 7: precipitação de proteínas, observar a precipitação em decorrência da adição de sais -(NH4)2SO4-; de ácido (tricloroacético) e a influência do calor quando a solução for colocada em banho-maria. Já no experimento nº8: carga elétrica das proteínas, determinar o pI da caseína observando sua turbidez e precipitação na solução.

Materiais e Reagentes:

Experimento nº 7: precipitação de proteínas

• Três tubos de ensaio;

• Frasco contendo água destilada;

• Frasco contendo a solução de proteínas;

• Frasco da solução saturada de Sulfato de amônio;

• Frasco contendo a solução de ácido tricloroacético;

• Equipamento para o banho-maria.

Experimento nº 8: carga elétrica das proteínas

• Nove tubos de ensaio;

• Solução de caseína;

• Ácido acético 2 M;

• Ácido acético 1 M;

• Ácido acético 0,1 M;

• Ácido acético 0,01 M.

• pHâmetro

Métodos:

Experimento nº 7: precipitação de proteínas

No experimento número 1, foi utilizada uma solução de proteínas (clara de ovos) e solução saturada de sulfato de amônio. Para realização do experimento, colocamos em um tubo de ensaio 2mL da solução de proteínas e após, adicionamos outros 2mL da solução de sulfato de amônio. Anotamos o que foi observado, misturamos por inversão e observamos o que aconteceu. Após isso, adicionamos 2mL de água destilada e misturamos por inversão.

No experimento número 3, utilizamos a solução de proteínas que nos foi fornecida e a solução de ácido tricloroacético a 10 g/dL. Ao realizar o experimento, colocamos em um tubo de ensaio 1mL da solução de proteínas e adicionamos 0,5 mL da solução de ácido tricloroacético. Após isso, adicionamos 5mL da água destilada e observamos o que veio a acontecer.

Para a realização do experimento número 4, colocamos 5mL da solução de proteínas em um tubo de ensaio e levamos ele até o banho-maria por 5 minutos. Retiramos ao passar o tempo e observamos o resultado.

Experimento nº 8: carga elétrica das proteínas

Para a realização do experimento de determinação do ponto isoelétrico da caseína, numeramos os 9 tubos de ensaio fornecidos. Após a numeração, adicionamos ao tubo 1 4,0mL de água destilada e 0,5 de ácido acético a 0,01 M; ao tubo 2 adicionamos 4,4 mL de água destilada e 0,1mL de ácido acético a 0,1M; ao tubo 3 adicionamos 4,3 mL de água destilada e 0,2mL de ácido acético a 0,1M; ao tubo 4 adicionamos 3,7 de água destilada e 0,8mL de ácido acético a 0,1M; seguindo o experimento, foi adicionado ao tubo 5, 3,5 mL de água destilada e 1mL de ácido acético a 1M; ao tubo de ensaio de número 6 adicionamos 2,5mL de água destilada e 2,0mL de ácido acético a 1M; após, adicionamos ao tubo 7, 0,5mL de água destilada e 3mL de ácido acético a 1M; ao tubo 8 adicionamos 3,9mL de água destilada e 0,8mL de ácido acético a 2M; por fim, ao tubo 9 adicionamos 3,7mL de água destilada e 1mL de ácido acético a 2M.

Realizada as adições anteriores, adicionamos nos 9 tubos 0,5mL da solução de caseína que nos foi fornecida. Agitamos os tubos e observamos as precipitações e a turbidez de cada um. Utilizamos o pHâmetro para medir o pH de cada tubo e realizar as conclusões necessárias.

Resultados:

Experimento nº 7: precipitação de proteínas

A adição do sal sulfato de amônio (NH4)2SO4 na solução de proteínas aumentou a tendência dos radicais dissociáveis dos aminoácidos da molécula de proteína ionizar, aumentando a solubilidade e formando um precipitado. Com a adição de água destilada, houve uma reversão da reação anterior, pois o precipitado desapareceu. Caracterizando a precipitação de proteínas por adição de sais neutros uma reação reversível.

A adição de ácido tricloroacético na solução de proteínas ocasionou a interação dos íons negativos do ácido com as cargas positivas da proteína, levando a formação de um precipitado. A reação é mais intensa quando o valor de pH do meio for inferior ao valor do ponto isoelétrico