Teste de Coombs Indireto Permite a Identificação de Anticorpos Ante-eritrocitários no Soro

INTRODUÇÃO

O teste de Coombs indireto permite a identificação de anticorpos ante-eritrocitários no soro. É importante para a avaliação de gestantes Rh (-) (avaliação de sensibilização), em pacientes com Rh (-) para avaliação da variante Du e nas fases pré-transfusionais, especialmente em pacientes já transfundidos, em que pode ter ocorrido sensibilização para Rh e outros sistemas.

O teste indireto identifica in vitro diferentes anticorpos, de acordo com a fase do teste que apresentou positividade. O teste é realizado em quatro diferentes etapas, conhecido como: fase fria (reativos à temperatura ambiente), geralmente anticorpos da classe IgM; fase em meio proteico, identifica os anticorpos IgM e também anticorpos incompletos (da classe IgG); fase quente (à temperatura de 37°C), detecta anticorpos que só reagem a essa temperatura (geralmente IgG); e a última etapa, que identifica aglutininas da classe IgG e anticorpos fixadores de complemento.

A ocorrência de aglutinação e/ou de hemólise durante quaisquer das etapas indica a possibilidade da presença de anticorpos irregulares.

Os soros de Coombs utilizados nas provas são anticorpos humanos, produzidos pela injeção de globulinas humanas em animas (coelhos e cabras) que forma anticorpos contra as frações “Fc” (cristalizáveis) das globulinas humanas. Como estes anticorpos podem reagir com qualquer glubulina humana, é necessário, na execução da prova, lavar as hemácias antes de se acrescentar o soro de Coombs, a fim de remover todo e qualquer vestígio de soro ou plasma, deixando as recobertas apenas com os anticorpos específicos que estão sendo pesquisados.

Os soros de Coombs podem ser poli específicos ou moo específicos. Os poli específicos contêm, além de anticorpos contra as imunoglobulinas humanas, anticorpos contra a fração C3 (C3b + C3d) do complemento que podem também sensibilizar a membrana eritrocitária. Os soros monoespecificos contém anticorpos contra apenas um tipo de imunoglobulina (IgG, IgM ou IgA) ou então contra frações do complemento (C3b, C3d ou C4). Este soro monoespecifico que contém exclusivamente anticorpos contra frações dos complementos é chamado de “Soro Anti-não-gama”, em contra posição aos outros que são chamados de “Soro Anti-gama”.

            Existem duas modalidades de prova de Coombs, a direta e a indireta. A prova indireta permite a pesquisa e identificação de anticorpos ante-eritrocitários (p. ex., no soro de uma gestante Rh- suspeita de está sensibilizada pelos antígenos do sistema Rh), provam de compatibilidade pré transfusionais e determinação de antígeno eritrocitário que não são evidenciados por aglutinação direta (p. ex., antígenos Duff, Kidd, Kell e outros). A prova de Coombs indireta consiste em incubar o soro suspeito na presença de hemácias conhecidas suspensas em solução fisiológica. Em casos positivos, as aglutininas do soro fixar-se-ão as superfícies das hemácias que, lavadas e expostas à ação do soro de Coombs, sofrerão aglutinação. A positividade da reação demonstra a existência de anticorpos não aglutinantes no soro do paciente.

Pode-se determinar o títulos do anticorpo, fazendo-se diluições progressivas do soro (1:2, 1:4, 1:8, 1:16 etc) e repetindo a prova. O título da prova corresponde a maior diluição de soro onde se verificou ainda aglutinação. O soro de uma gestante Rh-, considera-se que o título de 1:64 já é significativo para sensibilização pelo fator Rh. A sensibilidade da prova de Coombs indireta pode ser aumentada por procedimentos que modificam a primeira etapa da reação, ou seja, da fixação dos anticorpos durante a incubação. Os mais empregados são: adição de albumina ao meio uso de meio de baixa força iônica (LISS) e utilização de hemácias tratadas por enzimas proteolíticas.

 MATERIAIS

• Ponteira
• Tubo de ensaio
• Algodão
• Lamina
• Pipeta de Pasteur
• Centrifuga
• Pipeta de 100 microlitros
• Soro
• Soro anti-imunoglobulina

METODOLOGIA

Foi recolhido o tipo sanguíneo A- (fator RH-), o qual foi colocado para centrifugar em baixa rotação por dois minutos, Após a centrifugar separamos o plasma das hemácias com uma pipeta de pasteur e os colocamos em tubos de ensaios diferentes. Logo em seguida pegamos as hemácias tipo O+ (fator RH+) as quais foram lavadas com soro por três vezes e centrifugadas (lavagem realizada para retirar as impurezas para que não houvesse um falso positivo). Após a terceira lavagem retiramos o excesso de soro homogeneizamos as hemácias e realizamos a reação antígeno anticorpo. Com o auxilio de uma pipeta pipetamos 100 microlitros do plasma da mãe “Rh-“, e transferimos para o recipiente aonde se encontrava as hemácias “RH+”, homogeneizamos e colocamos 2 gotas do soro anti-imunoglobulina  humano (anti-humano) e novamente homogeneizamos o qual não houve aglutinação ou seja não foi sensibilizado com os anticorpos anti-rh. (teste de coombs indireto negativo).