Anatoksinı

TOXÓIDES

Serão descritas as vacinas, cujos preparos se baseiam em cultivos de bactérias

que excretam toxinas.Estas, são posteriormente submetidas a uma destoxificação, que consiste na destruição de suas propriedades tóxicas (através do formaldeido ou do calor, por exemplo), sem alterar as propriedades imunogênicas.A molécula de toxina, assim modificada é conhecida como toxóide ou anatoxina.Um método rápido, para detectar a presença de toxina no meio, consiste em colocá-la na presença de um soro que contenha os anticorpos contra esta toxina, também conhecido como soro padrão ou antitoxina.Ao ocorrer a combinação entre esses anticorpos e as moléculas da toxina, aparecerá uma floculação visível a olho nu. Esse método foi instituído por Ramon e permite exprimir a quantidade da toxina em termos de unidade de floculação (Lf/ml). Por ser rápido, é aplicado nos controles finais de qualidade e durante os cultivos em fermentador, sem a necessidade de grande número de animais de laboratório.

Nas provas de liberação das vacinas, o método “in vitro”, deverá também estar Obrigatoriamente acompanhado do teste “in vivo” .

TOXÓIDE DIFTÉRICO

Bactéria gram positiva Corynebacterium diphtheriae, é a causadora da difteria –

doença provoca infecção no trato respiratório superior, bem como na parte cutânea.A toxina diftérica é um polipeptídio, com PM ~ 62000. Há dois fragmentos na molécula, denominados A e B. O fragmento B é necessário para a penetração na célula que será afetada.7 Após penetração, o fragmento A é responsável pela toxidez, interferindo

enzimaticamente com a síntese protéica da célula afetada. Embora haja uma variedade de antígenos para ambos os fragmentos, os anticorpos dirigidos contra o fragmento B são aqueles que protegem contra a infecção.A presença de proteínas estranhas no toxóide, causa reações colaterais no paciente, como a febre. Com isso, a vacina é aplicada várias vezes em doses moderadas, com o objetivo de minimizar os efeitos indesejáveis.

O MÉTODO DE CULTIVO

O meio de cultura empregado para o cultivo do Corynebacterium diphtheriae foi

desenvolvido por Linggood e Fenton; sua composição para um litro e meio, é a

seguinte:

Carne bovina (~) 155g

Extrato de levedura em pasta 0,15g

Lactato de sódio 1,5ml

Maltose 50ml

Sulfato de magnésio 0,62g

β alanina 1,75mg

Ácido nicotínico 1,75mg

Ácido pimélico 0,11mg

Sulfato de cobre 0,75mg

Sulfato de zinco 0,60mg

Cloreto de manganês 0,22mg

pH 7,8

A carne é previamente digerida, por intermédio de uma solução com a seguinte

composição:

Papaína 1,5g

Solução de hidróxido de sódio 8,0ml

Ácido clorídrico 2,5ml

Ácido acético 6,0ml

Hidrocloreto de cisteína 0,25g

A formação da toxina não está associada á reprodução bacteriana: sua atividade

(medida em unidades floculantes: Lf/ml), se torna mensurável ao redor de 18

horas de fermentação. Atinge seu valor máximo em 200 Lf/ml com 40 horas. O pH

diminui nesse mesmo período de 7,8 para 7,5.

Se a aeração for insuficiente, a queda será mais pronunciada (de 7,8 para 6,5),

com produção mais baixa de toxina (100 Lf/ml).

O processo industrial de produção da toxina diftérica é constituído pelas etapas

de:

- fermentação;8

- filtração tangencial do meio fermentado;

- filtração molecular do filtrado;

- cromatografia;

- destoxificação;

- nova cromatografia;

- filtração esterilizante da toxina purificada;

- mistura com o toxóide tetânico (DT);

- ou este e a vacina contra coqueluche (DTP)

a filtração tangencial do meio fermentado visa a separação das bactérias do meio,

onde se encontra a toxina.A filtração molecular, separa os nutrientes residuais e os metabólitos da toxina.Na cromatografia – separação das moléculas por tamanho e carga, permitindo a obtenção de uma toxina de alta pureza.A destoxificação consiste em desnaturar a toxina pela ação do formaldeido a 37 0 C / 4 a 6 semanas, conduzindo ao toxóide ou anatoxina diftérica.Mais uma etapa de cromatografia purifica e concentra a anatoxina nos padrões estabelecidos.Ela pode ser misturada com o toxóide tetânico, constituindo na vacina combinada DT ou em mistura com a vacina pertussis, para se constituir na vacina tríplice DTP.