Coloração Diferencial (Teste De Gram)

INTRODUÇÃO

A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram. Corresponde ao procedimento mais importante da microbiologia. (LEVINSON, 2008)

É a técnica de coloração artificial mais importante e mais utilizada em bacteriologia. As bactérias coradas por esta técnica pertencem a duas categorias distintas: Gram positivas e Gram negativas. (SILVA FILHO et al., 2007).

Primeiramente é realizado um esfregaço que é fixado pelo calor e recoberto com o corante cristal violeta. Esta coloração é denominada primária e deixa as células com cor básica.

Após isso, a lâmina é lavada e recoberta com iodo. Lava-se a lâmina novamente e se coloca álcool para funcionar como agente descorante. Lava-se o álcool, aplica-se o corante safranina (ou fucsina). O esfregaço é lavado novamente e após secagem é observado ao microscópio.

Os diferentes tipos de bactérias reagem de modo distinto à coloração de Gram, pois diferenças estruturais em suas paredes afetam a retenção ou liberação de uma combinação de cristal violeta e iodo, denominada complexo cristal violeta iodo. Entre outras diferenças, as bactérias gram-positivas possuem parede celular de peptideoglicano mais espessa que as bactérias gram-negativas. (TORTORA, et al., 2010).

MATERIAL E MÉTODOS:

• Álcool 70%

• Água destilada

• Lamparina

• Alça de Níquel-cromo

• Tubo de ensaio contendo culturas de bactérias

• Duas Lâminas e duas lamínulas

• Copos plásticos com: Cristal Violeta, lugol, álcool, Fucsina e água destilada.

• Microscópios ópticos

• Papel toalha

• Pipetas de plástico

• Óleo de imersão

• Cronômetro

A professora disponibilizou os dois tubos de ensaio preparados anteriormente pelo grupo que deveriam conter culturas de bactérias puras (axênicas), como o grupo só conseguiu crescimento bacteriano em uma placa de Petri os dois tubos de ensaio tinham bactérias provenientes da mesma placa de Petri.

Preparação das lâminas:

Feito a assepsia da bancada utilizando álcool 70% e papéis toalha, aceso a lamparina, pegou-se a alça de níquel-cromo e duas lâminas. Para melhor distribuição das bactérias, com o auxílio de uma pipeta uma gota de água destilada foi dispersa sobre cada lâmina.

A alça de níquel-cromo foi levada ao fogo da lamparina até chegar ao rubro e então foram abertos os tubos de ensaio. Com o uso da alça de níquel-cromo foi feita uma retirada de parte de uma colônia de bactérias amarelo forte de um dos tubos de ensaio e realizado um esfregaço no sentido longitudinal da lâmina. Essa lâmina foi passada no fogo da lamparina quatro vezes para que o material fosse fixado, essa lâmina foi chamada de lâmina 1.

No outro tubo de ensaio continha também uma colônia de bactérias de cor amarelo forte e foi realizado o mesmo procedimento que descrito anteriormente e feita a lâmina 2.

Testes de Gram:

As duas lâminas passaram pelo teste de coloração diferencial, que é composto por quatro etapas chamadas de Gram:

Gram 1: As lâminas foram cobertas, com auxilio de uma pipeta, pelo corante cristal violeta e deixadas assim por 3 minutos. Após esse tempo as lâminas foram lavadas com água destilada e o excesso de corante saiu com ela.