IMOBILIZAÇÃO DE LIPOXIGENASE EM DERIVADOS DE CELULOSE PARA APLICAÇÃO EM BIOSSENSORES

Este trabalho teve por objectivo a imobilização covalente da enzima lipoxigenase (E.C. 1.13.11.12) em suportes de derivados de celulose, o estudo da sua actividade e a caracterização dos suportes tendo em conta as alterações provocadas pelos processos de activação e imobilização, visando utilização futura em biossensores para determinação de micotoxinas em alimentos.

Numa primeira fase do trabalho, efectuou-se a preparação de membranas de hidrogénio acetato ftalato de celulose (CAP) por dissolução em dimetilsulfóxido (DMSO) e imobilização da lipoxigenase. Foram seguidos três métodos de activação do suporte e imobilização da enzima, sem grande êxito. Atendendo às dificuldades observadas com o CAP, propôs-se usar outros derivados da celulose (acetato de celulose (CA), butirato acetato de celulose (CAB) e etilcelulose (EC)) na forma de membranas obtidas por dissolução dos polímeros em tetrahidrofurano (THF), como suporte para a imobilização da lipoxigenase. A lipoxigenase foi imobilizada covalentemente nos derivados de celulose, previamente activados de duas formas distintas: a) activação dos suportes com recurso a periodato de sódio; b) activação dos suportes com periodato de sódio, inserção de um braço extensor de hexametilenodiamina, seguida da activação dos grupos amina com glutaraldeído. O processo de imobilização foi estudado no sentido de maximizar a actividade expressa pelas preparações de lipoxigenase variando factores como: i) a concentração da solução de periodato de sódio utilizada; ii) o tempo de contacto dos suportes com a solução de periodato de sódio; e iii) a concentração de enzima na solução preparada de lipoxigenase. Tanto para a lipoxigenase livre como para a lipoxigenase imobilizada, a actividade foi determinada medindo a velocidade de libertação de peróxido de ácido linoléico na reacção de hidroperoxidação de ácido linoléico, através de um ensaio espectrofotométrico a 234 nm, em condições de actividade máxima da lipoxigenase (25 oC e pH 9.0). A quantidade proteica de lipoxigenase imobilizada foi estimada com recurso ao método de Bradford. Determinaram-se e compararam-se as constantes de Michaelis-Menten, Km e as velocidades máximas, Vmax, da lipoxigenase livre e imobilizada. Foi realizado o estudo da estabilidade da lipoxigenase no suporte a 9 oC.

Numa segunda fase do trabalho estudaram-se as características dos suportes dos derivados de celulose (natureza hidrofílica/hidrofóbica dos suportes, capacidade de sorção de água, determinação de energia livre de superfície e o estudo da morfologia) com recurso a avaliação dos ângulos de contacto e microscopia

electrónica de varrimento (SEM), bem como as alterações que os procedimentos de activação e imobilização induziram nos suportes estudados de derivados de celulose.

Os resultados obtidos mostram que a eficiência e estabilidade da imobilização da lipoxigenase nas membranas de derivados de celulose são fortemente afectadas pelo procedimento de activação seguido e podem ser correlacionadas com o estudo das propriedades dos suportes. O melhor valor de actividade por mg de peso seco de suporte foi de 16.1 U/mgsuporte para o butirato acetato de celulose activado com periodato de sódio (1.0 M) por 3 horas, adição de braço extensor de hexametilenodiamina (1% (w/w)) e activação com glutaraldeído (5% (v/v)), seguido de imobilização