Zoxazolamina

BIOTRANSFORMAÇÃO HEPÁTICA DA ZOXAZOLAMINA

I - OBJECTIVO

Observar a capacidade da fracção microssomal hepática de rato em hidroxilar a zoxazolamina.

II - INFORMAÇÂO TEÓRICA

A zoxazolamina é um relaxante muscular de acção central que, embora não seja actualmente usado na terapêutica, é utilizado com fins ilustrativos dado que a sua acção farmacológica e metabolismo são facilmente determináveis. Os estudos de biotransformação da zoxazolamina, no homem, mostram que é principalmente metabolizada por hidroxilação, dando origem à 6-hidroxizoxazolamina (que é por sua vez conjugada com o ácido glucurónico) e em menor quantidade à clorozoxazona:

Figura 1. Metabolismo da zoxazolamina no homem (adaptado de La Du e colaboradores, 1971)

As reacções de oxidação envolvem enzimas associados à membrana do reticulo endoplasmático (ER) do hepatócito e em menor escala a células presentes noutros tecidos. As enzimas que catalisam estas reacções de Fase I são tipicamente oxidases; a maioria destas, são hemoproteínas mono-oxigenases da classe do citocromo P450 (CYP) Figura 2.

Figura 2. Oxidação de fármacos mediada pelo citocromo P450. Muitas reacções de metabolismo de fármacos

envolvem um sistema de enzimas P450 microssomais hepáticos, que catalisam a oxidação de fármacos. Esta reacção envolve um conjunto de passos de oxidação/redução nos quais o ferro do citocromo P450 actua como um portador de electrões na transferência de electrões do NADPH para o oxigénio molecular. O oxigénio na forma reduzida é então transferido para o fármaco, resultando um grupo adicional –OH no fármaco agora oxidado. A adição de um grupo-OH resulta num aumento da hidrofilicidade e numa velocidade de excreção do fármaco aumentada. B. O mecanismo detalhado da reacção de oxidação envolvida pode ser dividido em seis passos: (1) O fármaco complexa-se com o citocromo P450 oxidado; (2) O NADPH cede um electrão à flavoproteína redutase, a qual reduz o complexo fármaco– P450.; (3 and 4) O oxigénio junta-se ao complexo, e o NADPH cede outro electrão, gerando o complexo activado oxigénio –P450-substrato.; (5) O ferro é oxidado, com perca de água; e (6) Forma-se o fármaco oxidado (adaptado de Golan, 2008).

Estas enzimas (CYP) são também conhecidos como oxidases microssomais de função mista e estão envolvidas no metabolismo de muitos compostos endógenos (esteróides, lípidos, etc.) e na biotransformação de 75% de todos os fármacos usados hoje em dia. Há múltiplas isoformas das enzimas do citocromo P450, cada uma com diferente especificidade para os fármacos. Cinco dos CYPs Humanos (1A2, 2C9, 2C19, 2D6, e 3A4) contribuem para aproximadamente 95% das reacções oxidativas do metabolismo de fármacos.

III – FUNDAMENTO DO MÉTODO

Biotransformação da zoxazolamina

A zoxazolamina será incubada, durante 1 hora, com o sobrenadante pós-mitocondrial, (contendo a fracção microssomal hepática), aerobicamente, num sistema fortificado capaz de gerar NADPH.

-A fracção sobrenadante, pós-mitocondrial (10 000 g), contém não só, a fracção microssomal, como a fracção solúvel. A adição de NADP e glucose-6-fosfato ao meio de incubação, permitirá gerar NADPH:

Mg 2+ Glucose-6-fosfato + NADP+ 6-Fosfogluconolactona + NADPH + H+

Glucose-6-fosfato desidrogenase A glucose-6-fosfato desidrogenase está presente na fracção solúvel.

-Para permitir níveis adequados de NADPH, durante o tempo de experiência, será adicionada, ao meio de incubação a nicotinamida, prevenindo a destruição do nucleótido piridínico (NAD) pelas nucleotidases tecidulares:

NAD

Nicotinamida + ADP-ribose

NADase

A quantidade de zoxazolamina não alterada após incubação será subtraída à quantidade inicial (tempo zero) e esta diferença representará a quantidade de fármaco metabolizada ao fim de uma hora.

Doseamento da zoxazolamina não alterada:

Instrumentação:

O método de separação e quantificação da zoxazolamina, a partir do meio de incubação, é o da cromatografia de alta eficiência (HPLC). Será utilizado um sistema cromatográfico Hitachi composto por uma bomba de gradiente terciário (L-6200, intelligent pump), equipado com uma válvula de injecção manual (Rheodyne 7125) com uma ansa de 20 ul, ligado a um detector UV (L-4000), com comprimento de onda variável, sendo o comprimento de onda seleccionado de 278 nm. A este sistema é acoplado um integrador (D-2500) para registo e tratamento quantitativo dos cromatogramas.

Fase Estacionária: Coluna de fase inversa (C18) (12,5cm X 4mm d.i.), constituída por partículas de 5 μm

de diâmetro (LiChrospher 100 RP-18, Merck).

Fase Móvel:

O sistema de eluição isocrático é constituído por uma solução eluente contendo:: 50 mM de KH2PO4 ,a pH=3 - trietilenamida - acetronitrilo (75;1;25, (v/v/v); . O fluxo é de 1 ml/min.

Identificação e quantificação da zoxazolamina não biotransformada

A identificação cromatográfica da zoxazolamina é efectuada por comparação com o tempo de retenção de um padrão de zoxazolamina com elevada pureza (>98%) e separada nas mesmas condições cromatográficas. O método de quantificação utilizado é o método do padrão externo. Para cada componente da mistura que se pretende quantificar é elaborada uma curva de calibração (gráfico da concentração em função da área do pico) que deve possuir um declive constante (linear) dentro do intervalo de concentrações para cada composto a analisar e a intercepção do eixo das ordenadas deve ser zero ou próximo de zero.

IV – PROTOCOLO EXPERIMENTAL

Preparação da fracção pós-mitocondrial

Ratos machos serão sacrificados por decapitação e os fígados removidos e colocados numa solução gelada de KCl a 1,15%. O tecido será posteriormente cortado em pequenos pedaços e homogeneizado em 2 volumes de KCl gelado Figura 3.

Figura 3 . Homogeneização do fígado de rato utilizando um tubo de vidro Potter-Elvehjem e um pistão de teflon (adaptado de La Du e colaboradores ,1971)

Nesta operação será desintegrado o tecido