Processos Industriais Bioquímicos

1. INTRODUÇÃO

O método de diluição em placa para isolamento de micro-organismos do solo vem sendo usado há décadas, desde 1950. Muitos micro-organismos importantes foram isolados dessa forma, como Actinoplanes, Streptosporangium, Microbispora, Microellobosporia, entre outros (THIEMANN, 2012).

Esse método é aplicado com a dissolução de uma determinada amostra de solo em água purificada estéril. Essa dissolução pode ser diluída de 10-1à 10-10, dependendo da quantidade necessária para o tipo de análise que será utilizado. Amostras das diluições são pipetados no centro das placas de petri que contém meio de cultura que seleciona/favorece o micro-organismo foco do estudo (JAHNEL; CARDOSO; DIAS, 1999).

2. OBJETIVO

2.1. Parte 2

Analisar a ação dos microrganismos obtidos do solo no crescimento e/ou morte de outros microrganismos, incluindo bactérias Gram positivas e Gram negativas.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Parte 1

Para o desenvolvimento do método de isolamento de micro-organismos do solo por diluição em placa, foram utilizados os materiais e reagentes descritos na Quadro I abaixo.

Quadro I – Materiais e reagentes utilizados.

Placas de petri em meio de cultura BDA Alça de drigalski de vidro

Erlenmeyer 250 mL estéril Bico de bunsen

Pipetas volumétricas estéreis de 1 mL e 0,1 mL Solução salina (85%)

Tubos de ensaio estéreis Amostra de solo

Fonte: Produzido pelos autores

Iniciou-se o procedimento identificando as placas de petri de acordo com as diluições a serem realizadas. Em erlenmeyer contendo 90 mL de solução salina (85%) foram adicionados 10,03 g da amostra de solo, sob agitação para homogeneização da solução de solo.

Para a diluição das amostras em um tubo de ensaio contendo 9 mL de solução salina adicionou-se 1 mL da solução de solo e agitou-se formando uma solução de solo com 10-1. Em seguida em outro tubo de ensaio contendo 9 mL de solução salina adicionou-se 1 mL da solução de 10-1, alcançando uma concentração da solução de solo de 10-2. O mesmo procedimento foi realizado por mais duas vezes, até a concentração de 10-4.

Após o preparo das diluições, em meio de cultura BDA (BATATA – DEXTROSE – ÀGAR), adicionou-se 0,1 mL da solução de solo de 10-2 em 1 placas de petri, em seguida plaqueou-se com o auxilio da alça de drigalski flambada, próximos a chama do bico de Bunsen e em movimento circulares para o espalhamento da amostra. As demais diluição foram realizadas seguindo o mesmo procedimento.

A diluição de 10-3 foi plaqueada em 2 placas de petri e a solução de 10-4 foi plaqueada em 1 placa de BDA.

Por fim as placas inoculadas foram incubadas em estufa à 30°C por 72 horas.

3.2. Parte 2

Os materiais utilizados para o desenvolvimento desse experimento estão apresentados na Quadro II abaixo.

QuadroII – Materiais Utilizados

Tubo de ensaio com suspensão de Candidaalbicans Pinça

Tubo de ensaio com suspensão de Escherichia coli Loop calibrado de platina

Tubo de ensaio com suspensão de Bacillus subtilis Fósforo

Tubo de ensaio com suspensão de Staphylococcus aureus Pisseta de hipoclorito

Placas de petri grande com meio BHI Caneta

Placa de petri grande com meio SAB Descarte de pipetas

Pipetas de 1 mL estéreis Frasco com álcool para flambar a alça de Drigalski e o Loop

Alça de Drigalski

Fonte: Elaborada pelo grupo

O procedimento inicia-se com a divisão das placas de BHI (Brain Heart Infusion) e SAB (Sabourand) em 6 partes iguais, marcando o fundo do vidro com a caneta. Em seguida, selecionar 6 micro-organismos que cresceram nas placas isoladas na Parte 1 do experimento.

Em seguida, inocular a placa de SAB com 0,1 mL da suspensão da levedura Candidaalbicans com um pipeta estéril de 1 mL. Após inoculação, molhou-se a alça de drigalski no álcool, flambando-a na chama do bico de Bunsen para semear a levedura por toda a placa uniformemente. Este procedimento foi repetido nas outras 3 placas de BHI que foram inoculadas com Escherichia coli, Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.

Após o tempo de secagem das 4 placas inoculadas, estas mesmas placas foram semeadas com amostras de 6 micro-organismos crescidos nas placas de diluição do solo. Este procedimento iniciou-se com a placa de SAB que havia sido dividida em 6 partes iguais na sua base de vidro, cada parte foi numerada de acordo com o micro-organismo que seria depositado ali.

Primeiramente, o Loop calibrado de platina foi molhado em álcool e flambado na chama do bico de Bunsen, em seguida era coletada uma pequena porção do micro-organismo de solo desejado e sua massa era depositada sobre o ágar cultivado, na área destinada a ele, repetindo esta etapa para todos os 6 micro-organismos selecionados. Este procedimento repetiu-se para as outras 3 placas de BHI.

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