Desenho de Primers Para Detecção da Doença de Huntington Através de PCR

Desenho de Primers para detecção da Doença de Huntington através de PCR:

Aplicação do Estudo Molecular para Investigação da Doença de Huntington:

        A Doença de Huntington (DH) é uma doença neurológica transmitida hereditariamente como uma herança autossômica dominante de penetrância completa, ou seja, todos os indivíduos que possuírem o genótipo para DH irão apresentar sinais e sintomas em algum momento da sua vida.

        O gene mutante na doença de Huntington (huntingtin gene) está localizado próximo a extremidade telomérica do braço curto do cromossomo 4 (região 4p16.3). Este gene possui 180kb e contém 67 éxons, que codificam uma proteína chamada "Huntingtina", a qual contém 3.144 aminoácidos, e está presente no cérebro e em diferentes tecidos do organismo.

        Próximo a extremidade 5 'da região codificadora do gene estão presentes repetições em tandem do trinucleotídeo CAG (C=citosina, A=guanina e G=guanina) na extremidade distal do gene. A trinca de trinucleotídeos CAG é responsável pela transcrição do aminoácido glutamina e a repetição sequencial de até trinta e cinco aminoácidos (poliglutamina) é característica da estrutura molecular normal da proteína Huntingtina.

        A anormalidade no gene foi identificada como repetições expandidas instáveis deste trinucleotídeo CAG. Portanto, nos cromossomos normais há entre 5 e 35 repetições sendo que a grande maioria possui aproximadamente 18 repetições. Já nos pacientes com DH as repetições são na ordem de 40 a 100. Indivíduos assintomáticos com 33 a 39 repetições ficam em uma faixa indeterminada em relação ao diagnóstico e à capacidade de estimar o surgimento ou não da doença.

Fonte Consultada: Genomika – Hospital Israelita Albert Einstein        https://www.genomika.com.br/exames/HUNTINGTON/

Acesso em 07 de setembro de 2017.

Desenho de primers:

        Para desenhar os primers, você deve primeiramente conhecer a sequência do gene que será amplificado.  Para obter a sequência, vá ao GenBank, digite “huntingtin” na janela de busca e clique “Search”.

        O resultado da busca irá mostrar as sequencias de nucleotídeos que já foram descritas na literatura para este gene. Você deve procurar uma sequência que corresponda a “homo sapiens” (provavelmente o primeiro resultado de busca já é a sequência correta). Clique neste resultado.

        Na janela de resultados, procure na sequência de nucleotídeos do gene, onde estão localizadas as repetições CAG, relacionadas ao desenvolvimento da doença. Esta sequência de repetições inicia na posição 197 e termina na posição ___259____. Sendo assim, na sequência descrita na literatura existem ____21___ repetições de CAG.

Esta sequência dará origem a uma proteína normal? ( X ) Sim (   ) Não

        Na mesma janela de resultados, logo abaixo do nome do gene, clique em FASTA. Este comando irá retirar os números de guia que você estava usando para localizar a sequência de interesse. Uma nova aba irá abrir com a sequência de nucleotídeos do gene. Copie esta sequência.

        Abra em uma nova janela o seguinte endereço: primer3.ut.ee

        Cole a sequência de nucleotídeos no retângulo do início da tela. Adicione um colchete no início da sequência de repetições CAG e um no final [CAGCAGCAG....]. Isto irá selecionar a região do gene que você tem interesse em amplificar. Clique em “Pick primers”. Uma nova aba irá abrir com os primers desenhados.

Sobre os primers desenhados complete:

Sequência do LEFT PRIMER: CCTTCGAGTCCCTCAAGTCC

Sequência do RIGHT PRIMER: TCTTTCTTTGGTCGGTGCAG

Tamanho do amplicon que será gerado: 250pb

Temperatura de anelamento dos primers: primer left = 49,57 primer right = 58,41

ILUSTRAÇÃO DO PORTAL GENEBANK E DOS ÍCONES DE ACESSO ÀS INFORMAÇÕES SOBRE PUBMED, ANÁLISES DE SEQUÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS-PREDIÇÃO E POLIMORFISMOS

Anotações:

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