Diálise, Teste Da Ninidrina E Biureto

1. Objetivos

Aplicar o conhecimento sobre proteínas e aminoácidos, através da ilustração das técnicas de diálise, testes da ninidrina e biureto e precipitação isoelétrica, adquiridos durante as aulas teóricas de bioquímica.

2. Introdução

2.1 Diálise

A diálise é utilizada para separar moléculas grandes e pequenas e depende do fato de uma membrana semi-permeável permitir que as pequenas moléculas passem através dela mas impedir a passagem de grandes moléculas. Na prática, uma mistura de moléculas grandes e pequenas é colocada em um saco de diálise imerso num grande volume de solvente aquoso. As pequenas moléculas passam através da membrana para o fluido externo até que o equilíbrio seja atingido.

A taxa de diálise depende de vários fatores:

- qualidade da membrana

- permeabilidade da membrana

- natureza do solvente

- temperatura

- pressão.

Envolve conceitos de difusão e osmose.

A difusão molecular é o movimento das moléculas do fluído. No entando, este transporte ocorre no sentido inverso, de uma solução menos concentrada (hipotônica) para uma solução mais concentrada (hipertônica).

Osmose é um tipo de difusão molecular, que envolve o movimento da água entre meios que são separados por uma membrana semi-permeável.

2.2 Testes para determinação de aminoácidos

Todos os alfa-aminoácidos possuem em sua estrutura um grupo funcional amino e um ácido carboxílico ligados ao carbono alfa. Através das ligações peptídicas, estes deixam de existir nesta forma para originar a molécula de proteína. O que diferencia os resíduos desses aminoácidos são suas cadeias laterais (R), que resultam em diferentes características físico-químicas.

A determinação destes aminoácidos vem sendo usada na pesquisa para se conhecer a composição das proteínas. Há diversas formas de se realizar esta determinação, como por exemplo, cromatografia líquida de alta eficiência hidrofílica (separação e purificação de peptídeos, ácidos nucléicos e outros compostos polares), reação de Hopkin-Cole e reação de Milor (proteínas que reagem com uma variedade de reagentes, formando produtos coloridos).

2.2.1 Teste da Ninidrina

O teste da ninidrina é um teste geral para aminoácidos, podendo ser usado de uma forma qualitativa, em geral para detectar a presença de aminoácidos em meios de suporte para cromatografia ou eletroforese de uma forma quantitativa (por exemplo, para dosear aminoácidos após separação cromatográfica de hidrolisados proteicos, na determinação da composição em aminoácidos de proteínas). A reação da ninidrina é usada na detecção de aminoácidos por ser característica da função amina primária. A ninidrina é um poderoso agente oxidante que reage com -aminoácidos, entre pH 4 e 8, originando um composto púrpura, que não apresenta sempre a mesma intensidade de coloração. Os aminoácidos prolina e hidroxiprolina são exceções pois apresentam coloração amarela.

2.2.2 Teste do Biureto

As soluções aquosas de compostos contendo duas ou mais ligações peptídicas (por exemplo, proteínas) dão origem ao aparecimento de uma cor violeta característica quando tratadas com uma solução diluída de sulfato de cobre em meio alcalino. O nome do teste vem do composto biureto que dá uma reação tipicamente positiva. A cor é devida à formação de um complexo em que o cobre se coordena a quatro átomos de azoto das ligações peptídicas, a intensidade da cor varia com a concentração de proteínas.

2.3 Ponto Isoelétrico Os aminoácidos apresentam dois grupos que são passíveis de sofrer protonação (adição de H+) e desprotonação (retirada de H+). Observe:

A figura demonstra as etapas de ionização em que podem ser encontrados os aminoácidos:

1. Forma positivamente carregada.

2. Forma eletricamente neutra. Note que existe uma densidade de carga negativa e uma densidade de carga positiva sobre a molécula, conferindo carga total nula. Essa forma também é denominada isoelétrica ou zwitteriônica.

3. Forma negativamente carregada

Essas formas são encontradas em maior ou menor quantidade dependendo do pH em que a solução do aminoácido se encontra. Isso porque quanto menor o valor de pH, maior a concentração de íons H+ em solução e, conseqüentemente, maior a prevalência da forma positivamente carregada (1). Em contrapartida, quanto maior o valor de pH, menor a quantidade de íons H+ em solução, havendo prevalência da forma negativamente carregada (3). A forma eletricamente neutra (2) só poderá existir, então, numa condição de pH intermediária à existência predominante da forma positiva e negativa do aminoácido. Esses valores de pH podem ser facilmente determinados experimentalmente e também podem ser estendidos às proteínas, ou seja: as proteínas também apresentam uma distribuição de cargas, que pode ser alterada em função do pH.

O ponto onde a carga líquida total da molécula de aminoácido ou proteína é nula é tão importante, que recebeu uma denominação especial. Assim, o valor de pH onde existe equivalência entre as cargas positivas e negativas da molécula é denominado ponto isoelétrico.

A caseína contém um número razoavelmente alto de peptídios de prolina que não interagem. Não apresenta nenhuma ponte dissulfeto. Como consequência apresenta relativamente pouca estrutura secundária ou estrutura terciária, não formando estruturas globulares. Por isso não pode desnaturar. É relativamente hidrofóbica, tornando-se pouco solúvel em água. Encontra-se no leite como uma emulsão de partículas de caseína (micelas de caseína), de modo que a região hidrófoba (apolar) fica no interior e a região hidrófila (polar) na superfície exposto a água. As caseínas das micelas se prendem juntas por íons de cálcio e interações hidrofóbicas.

Além de ser consumido no leite, produção de derivados do leite