A Determinação da atividade da succinato desidrogenase

Determinação da atividade da succinato desidrogenase

Nomes: Edgar L. W. e Luiza C. P. | Cadeira: CBS1035 | Data: 19/06/17
Universidade Federal do Rio Grande do Sul[pic 1]

INTRODUÇÃO

A succinato desidrogenase, succinato-coenzima Q redutase ou complexo II é uma flavoproteína ligada à membrana interna mitocondrial que intervém no ciclo de Krebs e na cadeia respiratória e que contém FAD (dinucleótido de flavina e adenina) unido covalentemente. Possui oito átomos de ferro e oito átomos de enxofre lábeis frente aos ácidos.[pic 2]

A molécula de FAD da enzima, é o aceptor de elétrons da reação.

A função da succinato desidrogenase é retirar dois hidrogênios da molécula de succinato, que é gerada a partir da perda da coenzima A de um succinil CoA. Os hidrogênios removidos são captados pelo FAD, que é reduzido a FADH2.

A enzima succinato desidrogenase possui algumas características de uma enzima alostérica: é ativada pelo succinato, o fosfato, o ATP e o coenzima Q reduzido , e é inibido pelo malonato, um análogo estrutural do succinato.

METODOLOGIA

Para essa prática, foram utilizadas mitocôndrias isoladas em um sistema de incubação livre de citoplasma. Para marcar transferência de elétrons, foi utilizado o DCPIP, que interage com a Succinato desidrogenase-FADH2. O DCPIP fica reduzido, e apresenta uma menor absorbância.

As amostras foram preparadas de acordo com a tabela a seguir:

Tubos	Tampão fosfato (ml)	DCIPIP 0.0017M (ml)	MgSO4 (ml)	H2O(ml)	Succinato de Sódio 0.4M(ml)	Succinato de Sódio 0.01M(ml)	α-cetoglutarato 0.1M(ml)	Glicose 5mM(ml)
1	1,0	0,2	0,2	4,2	-	-	-	-
2	1,0	0,2	0,2	4,0	-	0,2	-	-
3	1,0	0,2	0,2	3,8	0,4	-	-	-
4	1,0	0,2	0,2	2,8	1,4	-	-	-
5	1,0	0,2	0,2	4,0	-	-	0,2	-
6	1,0	0,2	0,2	3,8	-	-	0,4	-
7	1,0	0,2	0,2	2,8	-	-	1,4	-
8	1,0	0,2	0,2	3,8	-	-	-	0,4

Os tubos foram então agitados e transferidos uma alíquota para a placa e realizado a leitura inicial em 650nm imediatamente. E os tubos foram incubados por 10 minutos a 37°C e no fim deste tempo retirou-se uma nova alíquota para a leitura. Os tubos voltaram a incubação e esperou-se mais 10 minutos, totalizando 20 minutos e repetiu-se o processo de medição.

RESULTADOS[pic 3][pic 4]

*Não foi inserido o preparado mitocondrial nos tubos 3 e 4.

TAXA DE REAÇÃO:

Tubo 1= -0,280

Tubo 2= -0,009

Tubo 3= erro experimental

Tubo 4= erro experimental

Tubo 5= 0,043

Tubo 6= 0,012

Tubo 7= 0,010

Tubo 8= 0,005

DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

1. Qual a importância do grupo 1 para o cálculo da atividade?

O grupo 1 foi utilizado como controle do experimento, que permitiu avaliar a ação do DCPIP com a solução mitocondrial.

1. Como, utilizando os dados obtidos no experimento, você calcularia a atividade do ciclo de Krebs e da cadeia transportadora de elétrons no sistema experimental utilizados?

A leitura inicial representa a quantidade de moléculas de DCPIP presentes na solução. Sempre que ocorrer a conversão de succinato em fumarato, o DCPIP receberá elétrons do FAD da succinato desidrogenase ficará incolor. Quanto mais rapidamente a solução ficar incolor, maior a velocidade do ciclo. Para saber quantitativamente, basta saber a quantidade inicial de mols de DCPIP adicionados e a absorbância inicial e comparar esses valores com a absorbância final.

1. O Cloreto de Iodofenil Tetrazólico possui potencial de redução 0,09V. Se este corante fosse utilizado na reação ao invés de DCPIP, como seria a velocidade da succinato desidrogenase?

O que faz com que o DCPIP receba os elétrons da reação é seu potencial de redução, que é 0,02V. Se substituirmos o DCPIP pelo Cloreto de Iodofenil Tetrazólico, que tem um poder de redução muito maior, a diferença de potencial seria aumentada, o que faz com que ele possa receber elétrons com muito mais facilidade. Isso faz com que a velocidade da succinato desidrogenase seja maior.

1. Como você explicaria a diferença de atividade entre os grupos de succinato e α-cetoglutarato?

Todas as enzimas e moléculas necessárias para a degradação de succinato estão presentes nas mitocôndrias, por este motivo, o ciclo de Krebs pode ocorrer. Isso leva a uma diminuição da absorbância do DCPIP. No caso do α-cetoglutarato, não houve decréscimo da absorbância, o que indica que o ciclo não ocorreu. Isso se deve à ausência de NAD e CoASH e pela grande diferença do potencial de redução do DCPIP em relação ao potencial do NAD.