Métodos Utilizados na Extração do Ácido Desoxirribonucleico

Os métodos utilizados na extração do ácido desoxirribonucleico (DNA) são semelhantes, diferem na natureza do material biológico (bactérias, fungos, tecidos vegetais e tecidos animais) de onde o DNA será extraído. O princípio da extração consiste na lise celular (ruptura da membrana plasmática, que libera o DNA localizado no núcleo) e na purificação do DNA obtido Ref. [1].

Na lise celular é empregado o uso de detergentes, que tem como função desestabilizar os lipídios presentes na membrana plasmática, liberando o material genético. A fase de purificação do ácido desoxirribonucleico é importante para se obter alta eficiência da amplificação de sequências do DNA, nela ocorre reações enzimáticas ou interações entre macromolécula que possibilitam a retirada dos contaminantes presente no DNA [1]. A técnica de reação em cadeia polimerase (PCR) é amplamente usada devido a facilidade na aplicação de regiões específicas no genoma [3].

A PCR tem alta sensibilidade, especificidade, facilidade de execução e a capacidade de analisar um grande número de amostra simultaneamente. Para a amplificação acontecer as partes finais da sequência do DNA devem ser conhecidas, a solução em que este processo ocorre é preparada em banho de gelo [3].

A composição da PCR de acordo com Oliveira consiste em: amostra de DNA com o segmento de interesse, Mistura que contenha os nucleotídeos necessários para sintetizar novas fitas de DNA, enzima DNA-polimerase (responsável pela síntese de novas fitas do DNA em solução tampão), cofator da reação (cloreto de magnésio) e dois iniciadores ou primers (pequenas sequência conhecida de DNA, que delimitam e são complementares a região de interesse da sequência de DNA), a solução é armazenada em microtubos plásticos.

Para ocorrer com eficiência a técnica de PCR as amostra devem estar em ambiente que tenha temperatura adequado e o tempo de permanência adequado, para isso é necessário colocá-las em um termociclador, onde as amostras são incubadas. A PCR consiste em três fases desnaturação (fase em que o DNA perde a estrutura de dupla hélice, por elevação de temperatura), anelamento (nessa etapa a temperatura é específica para cada primers, assim eles se encaixam na sequência complementar) e extensão (eleva-se a temperatura de modo que o DNA-polimerase se liga aos primers, com o auxílio do magnésio, para iniciar a síntese de nova fita do DNA) [3].

No fragmento de DNA utilizado na técnica de PCR existem as regiões de interesse do pesquisador, elas são fragmentadas pelas enzimas de restrição que colocamos juntos com a solução da PCR. Estas enzimas reconhecem determinadas sequências nucleotídicas do DNA e recortam a molécula sempre que as identifica, resultando em extremidades coesivas, essas extremidades se conectam com as outras, emparelhando por complementaridade [2].

Para ver o resultados de todas as etapas ditas anteriormente o método de eletroforese é necessário. A eletroforese consiste na separação, identificação e purificação dos fragmentos de DNA obtidos na PCR, esta técnica é eficiente e rápida [2]. O presente relatório tem como objetivo observar por meio da eletroforese se a técnica de extração de DNA e as enzimas de restrição obtiveram os resultados desejados.

[1]. ALVES, A. E; SOUZA, S. D. Biologia molecular.