Os Marcadores Moleculares

                                                                            Marcadores Moleculares

         Os marcadores moleculares vêm sendo utilizados para desvendar sequencias de DNA para vários fins. Eles são sequencias de DNA que diferenciam dois ou mais indivíduos. Devido ao fato de serem características herdáveis e estáveis, os pesquisadores os utilizam para aumentar a quantidade de informações de uma espécie, maximizando as diferenças e aumentando a diversidade genética. A utilização dos marcadores moleculares tem sido aplicada na análise de diversidade genética e da biodiversidade. A variação de uma mesma região gênica em indivíduos diferentes, embora da mesma espécie, recebe o nome de polimorfismo. A análise de informações genômicas tem tido grande avanço com a utilização dos marcadores moleculares. Com a evolução dessas técnicas, cada vez mais informações são descobertas. Entretanto, uma das desvantagens é o custo de algumas técnicas, o que dificulta sua utilização na rotina dos laboratórios. Outro problema é a extrema sensibilidade à contaminação de algumas dessas técnicas, ocasionando resultados de interpretação duvidosa. Existem diferentes técnicas que permitem identificar diretamente os polimorfismos de DNA.Existem dois tipos de marcadores moleculares, os que hibridizam que são os RFLP e minissatélites ou lócus VNTR, e os que amplificam, que são os do tipo RAPD; SCAR; STS; microssatélites ou SSR e AFLP. Os que hibridizam possuem uma grande desvantagem sendo de grande custo e tempo para realiza-los. Como vantagem estes marcadores possuem uma consistência nos resultados. O VNTR possui um alto grau de polimorfismo. Os que amplificam possuem uma baixa consistência nos resultados, mas em compensação o tempo de obtenção dos resultados e a facilidade no uso dessas técnicas, além dos custos, vêm colocando estes marcadores nos mais utilizados pelos pesquisadores.

Marcadores Moleculares Revelados por Hibridização- Tipo RFLP

        O polimorfismo de comprimento de DNA fragmentado (RFLP), consiste de várias etapas como a extração de DNA; digestão com enzimas de restrição; separação dos fragmentos por eletroforese; transferência do DNA para uma membrana de nitrocelulose; hibridização da membrana com sonda molecular radioativa; e exposição da membrana a filme de raios X. Para a realização dessa técnica, três fatores devem ser levados em conta. O primeiro é o tipo de DNA a ser analisado, o segundo é o substrato eletroforético a ser usado, e terceiro, os métodos de visualização dos fragmentos. A variabilidade, obtida com as clivagens das enzimas de restrição, é o reflexo de mutações pontuais

ou ainda rearranjos que possam ter ocorrido em uma determinada região, ou ainda substituições da base nitrogenada na sequência de nucleotídeos, a qual é reconhecida por uma determinada enzima de restrição, alterando, dessa forma, o número de sítios de clivagem e, como consequência, o tamanho e o número dos fragmentos. Existem três métodos de visualização dos fragmentos: quando se possui mais de 50ng de DNA por banda, utilizando o brometo de etídio; quando detectado em pequenas quantidades de DNA (picogramas), utiliza-se a coloração por prata; quando ocorre a marcação das moléculas de DNA com fósforo ou enxofre radioativos, é utilizado um filme de Raios-X para visualizar o fracionamento dos fragmentos no gel.

Tipo minissatélites ou locos VNTR

     São sequências de DNA cuja unidade repetitiva é observada lado a lado inúmeras vezes em um locus, e que se repetem também em vários outros loci no genoma. Uma sequência repetitiva minissatélite, isolado do núcleo, pode ser utilizado como sonda para gerar em uma única reação uma impressão digital do DNA de um organismo. Por amostrar inúmeros locos ao mesmo tempo, este perfil eletroforético observado é muitas vezes suficiente para identificar e diferenciar um indivíduo do outro, com base nas variações observadas no DNA. A medotologia dessa técnica baseia-se na procura de pequenos números variáveis de sequências idênticas repetidas lado a lado, possuindo de 15 a 100 pares de bases e, são repetidas até 50 vezes. Os minisatélites constituem uma variação da técnica RFLP, modificando o tipo de sonda, o número e tipo de seqüência repetida.

2.0 Marcadores moleculares revelados por amplificação.

Tipo PCR

    A técnica baseia-se na capacidade da DNA polimerase de replicar sequências de DNA em certas condições laboratoriais a partir de um par de pequenos fragmentos iniciadores da fita réplica (primers) que flanqueiam a sequência que se deseja amplificar. Uma determinada sequência de DNA é amplificada, ciclo após ciclo (variações alternadas e cíclicas de temperatura - desnaturação; anelamento; extensão), em progressão geométrica, o que torna possível sua visualização em gel de eletroforese na forma de uma banda. Atualmente, dada a constante inovação e facilidades dos protocolos para extração de DNA, as facilidades na síntese de iniciadores e ao custo cada vez menor da enzima, técnica de PCR como diagnóstico tem sido cada vez mais utilizada na fitopatologia, principalmente nos casos onde o diagnóstico precoce é imprescindível para produtividade.

Tipo RAPD

   O emprego de técnicas baseadas na amplificação enzimática de DNA tem grande apelo por não ser necessário conhecimento a priori das sequências que serão amplificadas. Esta variação foi desenhada para contornar o problema do conhecimento prévio da sequência de DNA que se deseja amplificar, possibilitando a utilização da técnica em organismos onde não existia nenhum conhecimento da sequência de DNA. O princípio da técnica em primeiro lugar é construir iniciadores (primer) com sequências arbitrárias, que satisfaçam algum critério com relação às suas propriedades de hibridação. O procedimento mais comum é que tenham 10 nucleotídeos e que pelo menos 6 deles sejam C ou G. Utiliza-se um único primer, de tal forma que, se houver duas seqüências que hibridizem com esse primer, dispostas de modo palindrômico a uma distância igual ou menor que 2Kb, haverá amplificação do fragmento interno. A metodologia utilizada no RAPD é semelhante à do PCR. A diferença é que no RAPD, como a sequência dos primers (iniciadores) é aleatória, qualquer DNA que estiver contaminando a reação poderá ser amplificado e assim obter um resultado variável, sendo necessário um controle rigoroso da pureza dos materiais e do DNA. O polimorfismo detectado em um loco RAPD refere-se, em última análise, a mutações que ocorrem na fita de DNA impedindo o anelamento do primer a intervalos de fita que permitam a amplificação do segmento pela polimerase, inserções ou deleções de sequências.