PROCESSAMENTO DE MEDULA ÓSSEA

TÉCNICAS

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Índice

1. CULTURA DE LINFÓCITOS        2

2. BANDA GTG        3

3. PROCESSAMENTO DE MEDULA ÓSSEA        3

4. PROTOCOLO EXTRAÇÃO DNA (A PARTIR DO TRIZOL)        3

5. PROTOCOLO EXTRAÇÃO DNA (A PARTIR DO FENOL)        4

6. PROTOCOLO EXTRAÇÃO RNA (A PARTIR DO TRIZOL)        6

7. PROTOCOLO EXTRAÇÃO PROTEÍNA (A PARTIR DO TRIZOL)        6

8. PCR  (TESTE)        7

9. RECEITA DO GEL DE AGAROSE A 2%        8

10. RECEITA DO GEL DE POLICRILAMIDA A 10%        8

11. GEL PARA SEQUENCIAMENTO        9

12. QUANTIFICAÇÃO DE RNA OU DNA        9

13. PREPARO DE CDNA (COM O KIT)        10

14. CDNA (COMPLEMENTO DE DNA)         10

15. RECEITA DE cDNA COM O KIT HIGH CAPACITY        11

LADDER        12

16. REAÇÃO DE PCR- TEMPO REAL        12

17. QUANTIFICAÇÃO RELATIVA        13

18. QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA        14

19. QUANTIFICAÇÃO RELATIVA-MONTAGEM DA PLACA        16

20. EXTRAÇÃO DE KIT QIAGEN        17

REPETIR O PASSO 41 PARA DILUIÇÃO DE MAIS DNA!        19

21. PROTOCOLO siRNA - http://www.imprint.com.br/stacruz/        19

Segundo Angélica:        20

22. PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE  RNA (miRNA) – ANGÉLICA        21

23. PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNA A PARTIR DO TRIZOL  (modificada Malu)        21

24- PROTOCOLO PARA QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS (Bradford)        22

25-TECNICA DE APOPTOSE        26

26-CULTURA PRIMARIA        27

27-EXPANDIR CULTURA        27

28- CONGELAR CELULAS (by Mauricio)        27

29-DESCONGELAR LINHAGENS (by Kleiton)        28

30- WESTERN BLOTTING        28

 31- CITOTOXICIDADE: PROLIFERACAO COM XTT        32

32- EXTRACCAO DE PROTEINAS COM RIPA        32

1. CULTURA DE LINFÓCITOS

1- Em um tubo colocar:

- 9 ml de meio de cultura RPMI;[pic 1]

- 1 ml de sangue total;                Homogeneizar

- 0,25 ml de Fitohemaglutinina;

2-  Deixar a 37ºC por 72 horas;

                20' antes de completar as 72 horas aplicar 0,25 ml de colcemid;[pic 2]

3-                                                 OU

                  15' antes de completar 72hs aplicar 0,3 ml de colchicina (solução uso– 0,0016%)

4- Completada as 72 horas, retirar da estufa e colocar em tubo cônico;

5- Centrifugar 10-15 minutos à 1500 RPM;

6- Retirar o sobrenadante e adicionar ao sedimento 5 ml de solução hipotônica (KCL)  à 37ºC (pré-aquecida);

7- Homogeneizar bem e adicionar mais 5 ml de solução hipotônica (completando para 10 ml);

8- Colocar em estufa a 37ºC por 20 min;

9- Pingar 5 a 10 gotas de fixador preparado no momento de uso (metanol-ácido acético 3:1);

10- Homogeneizar e centrifugar 10 min;

11- Retirar o sobrenadante e adicionar 5-10 ml de fixador. Homogeneizar;

12- Deixar em repouso por 10 minutos em temperatura ambiente;

13- Centrifugar por 10 min;

14- Retirar o sobrenadante e adicionar 5-10 ml ed fixador. Homogeneizar e centrifugar 10 min;

15- Repetir a operação anterior mais uma ou duas vezes (até julgar necessário);

16- Retirar o sobrenadante, deixando em ± 1 ml de fixador para diluir o sedimento;

17- Pingar de 1 a 2 gotas do material em uma lâmina teste;

18- Corar com giemsa.

2. BANDA GTG

1- Adicionar:

         * 45 ml de tampão fosfato 0,06M juntamente com 5 ml de tripsina (solução final de tripsina 0,1%);

OU

*47,5 ml de  tampão fosfato com 2,5 ml de tripsina;

2- Colocar esta solução na estufa 37ºC.

3- Utilizar tempo variável de acordo com a idade da lâmina (quanto mais nova a lâmina, menos tempo);

4- Lavar em água;

5- Corar com giemsa;

3. PROCESSAMENTO DE MEDULA ÓSSEA

1. Despejar a MO ou sangue periférico em um tubo de Falcon;

1. Adicionar cloreto e bicarbonato até completar 25 ml (para que ocorra a lise das hemácias). Misturar o cloreto de amônio→7,704g/l (45ml) e o Bicarbonato de amônio→ 0,7g/l (5ml) em um tubo Falcon;

1. Agitar o conteúdo lentamente e centrifugar por 15 minutos a 3000rpm;

1. Desprezar a fase aquosa;

1. Aplicar de 500 a 1000µl de PBS (tampão) dependendo do tamanho do pellet (concentrado de leucócitos);

1. Adicionar Trizol LS reagente em uma quantidade correspondente a três vezes o volume de PBS aplicado;

1. Ressuspender;

8- Adicionar 1000µl da solução em cada ependorf e armazenar no freezer.

4. PROTOCOLO EXTRAÇÃO DNA (A PARTIR DO TRIZOL)

Reagentes:

Etanol absoluto

Citrato de sódio 0,1M em etanol 10%

Etanol a 75%

NaOH 8mM

A partir de 1ml de trizol inicial (volume usado para extração de RNA):

1-Adicionar 500µl(300?) de etanol absoluto e misturar por inversão (para que o DNA precipite).

-Incubar 2 a 3 minutos (temperatura ambiente)

-Centrifugar a 13.000rpm por 5 minutos.