¬Heterodimeric L-amino acid oxidase enzymes from Egyptian Cerastes cerastes venom: Purification, biochemical characterization and partial amino acid sequencing

Abstract:

- Isoformas Cc-LAAOI e Cc-LAAOII

- Purificadas em protocolo cromatográfico de duas etapas sequenciais: filtração com gel e cromatografia de troca aniônica.

- Peso molecular das isoformas é de 115 kDa, determinado pela filtração com gel. - Peso molecular monomérico das enzimas é 60, 56 kDa e 60, 53 kDa para LAAOI e LAAOII respectivamente.

- Valores ótimos de pH e temperatura para Cc-LAAOI e Cc-LAAOII são 7,8, 50 oC e 7, 60 oC, respectivamente.

- Ambas são termoestáveis até 70 oC.

- Valores de Km e Vmax são 0,67 mM, 0,135 umol/min para LAAOI e 0,82 mM, 0,087 umol/min para LAAOII.

- Ambas apresentam alta preferência catalítica por amino ácidos de cadeia longa, hidrofóbicos e aromáticos.

- Íon Mn2+ aumenta significativamente a atividade das duas isoformas, enquanto que Na+, K+, Ca2+, Mg2+ e Ba2+ aumentam não significativamente.

- Íons Zn2+, Ni2+, Co2+, Cu2+ e Al3+ inibem significativamente as atividades das LAAOI e LAAOII.

- L-Cisteína e GSH inibem completamente a atividade de ambas isoenzimas, enquanto que B-mercaptoetanol, O-fenantrolina e PMSF inibem completamente a atividade da LAAOII.

- Ácido iodoacético inibe a atividade enzimática de LAAOII em 46% e não tem efeito na atividade da LAAOI.¬

Introduction:

- L-aminoácido oxidases representam 1-9% das proteínas totais em venenos.

- snake venom LAAOs = flavoenzimas que servem para catalisar a desaminação oxidativa estereoespecífica de um L-aminoácido para dar origem a um alfa-cetoácido, amônia e peróxido de hidrogênio.

- A maioria dos sv-LAAOs são homodímeros com subunidades de pesos moleculares de cerca de 50 a 70 kDa e as formas nativas tem cerca de 120 kDa.

- As subunidades interagem através de interações não covalentes.

- sv-LAAO pode ser encontrada nas formas ácida, neutra e básica da proteína.

- Cristalografia de raios-X: sv-LAAO é um dímero funcional com cada dímero possuindo três domínios.

- Atividades biológicas = efeitos de agregação citotóxica, apoptótica e de plaquetas, atividades antiparasítica e bactericida – devido à atividade da L-amino oxidase das proteínas resultando na produção de peróxido de hidrogênio com radicais livres de oxigênio causando estresse oxidativo.

Material e métodos

# Purificação da enzima LAAO do veneno

- Coleta do veneno de cobras adultas no habitat natural.

- Veneno foi liofilizado e guardado a -20 oC (as amostras foram descongeladas e centrifugadas antes do uso)

- 100 mg de veneno dissolvido em 1 mL de tampão Tris-HCl 50 mM pH 8 – carregado na coluna (tampão usado para equilíbrio da coluna e eluição das amostras carregadas).

- Frações de 4 mL foram coletadas em vazão de 24 mL/h.

- As frações ativas contendo atividade de LAAO foram juntadas em um pool e aplicadas diretamente na coluna de separação equilibrada com o mesmo tampão.

- As proteínas não ligadas foram lavadas com o tampão de equilíbrio, enquanto que as proteínas ligadas foram eluídas usando 0-0,3 M NaCl com vazão de 36 mL/h.

- Frações de 3 mL foram coletadas e a atividade de LAAO foi determinada pelo método de Kishimoto e Takahashi.

- As frações apresentando atividade de LAAO foram juntadas em um pool, guardadas a 4 oC e designadas como Cc-LAAOI e Cc-LAAOII.

- Absorvância medida em 260 nm.

- Processos cromatográficos foram realizados em temperatura ambiente e as frações de enzima foram guardadas a 4 oC.

# Eletroforese com gel de poliacrilamida (PAGE)

- Sob condições não desnaturantes, com gel 10% acrilamida, método de Davis, usando Tris glicina, tampão pH 8,3. As bandas das proteínas foram localizadas utilizando coração com Coomassie blue.

# Determinação do peso molecular

- Filtração por gel

# Atividade da L-Aminoácido oxidase (LAAO)

- Foi realizado em microplaca, em duplicata. 10 uL da solução de enzima foi incubado com 90 uL de mistura de reação contendo 5 mM L-leucina como substrato, 0,81 U/mL HRP e 2 mM OPD em tampão Tris_HCL 50 mM pH 8,0 a 37 ºC. Após 1h, a reação foi finalizada com a adição de 20 uL de H2SO4 2 M.

- A quantidade de produto (H2O2) foi estimada medindo a absorbância