MÉTODOS PARA ATIVAR E INIBIR A ATIVIDADE ENZIMÁTICA

1. OBJETIVOS

O objetivo dos experimentos é demonstrar a ação de ativadores e inibidores na atividade da enzima polifenoloxidade, assim como demonstrar a eficiência de reagentes químicos e aplicação de calor como tratamento térmico para inativação da mesma.

2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A prática foi dividida em três experimentos: Ação de ativadores e inibidores da atividade enzimática, eficiência de reagentes químicos na inativação da Polifenoloxidade e eficiência da aplicação de calor na ativação da polifenoloxidade.

Experimento 1: Ação de ativadores e inibidores da atividade enzimática

A Figura 1 mostra os resultados de como os pedaços de banana reagiram após serem submersos nas soluções de Catecol 0,1 M, Sulfato de Cobre a 1%, Ácido ascórbico 0,02 M e em água destilada sendo o controle.

Foi possível observar que a banana no tubo de ensaio contendo catecol que é um substrato fenólico que possui monofenóis em sua cadeia, que são oxidados pela enzima e transformados em difenóis, que por sua vez, são oxidados em quinonas, surgindo assim as melanoidinas, responsável pela pigmentação escura dos tecidos vegetais. Sendo assim, o catecol ativou a enzima Polifenoloxidase, causando escurecimento na banana.

A PPO é uma metaloenzima e precisa de moléculas inorgânicas como o cobre para que realizem função de cofator da reação de escurecimento. Por isso, no tubo de ensaio contendo Sulfato de Cobre a 1%, ocorreu o escurecimento enzimático pois o Sulfato de cobre atua acelerando a intensidade da troca de elétrons, sendo um potente ativador da atividade da enzima.

O tubo de ensaio contendo o ácido ascórbico que é um agente acidulante, não apresentou escurecimento visível, isso ocorre porque a solução ácida é utilizada para manter o pH do meio abaixo do ótimo para a ação catalítica das enzimas em alimentos, inibindo a ação da atividade enzimática da Polifenoloxidase, também atua reduzindo as quinonas a sua forma anterior de fenóis e diminuindo a oferta de oxigênio no tecido cortado do vegetal, impedindo a formação dos pigmentos escuros.

No tubo contendo água destilada, foi observado que a água agiu como inibidor enzimático, provavelmente ocorreu devido a presença dos grupos hidrofílicos presentes na enzima, que podem ter se ligado a água, assim, diminuindo a formação do complexo enzima-subtrato.

Experimento 2: Eficiência de reagentes químicos na inativação de Polifenoloxidade

Após as fatias permaneceram submersas nas soluções de ácidos orgânicos por 7 minutos e serem retiradas e adicionados gotas dos reagentes catecol e água oxigenada a cada fatia de maçã e ser comparado a fatia de controle, foi observado que as fatias sem nenhum tratamento escureceram mais que as outras que foram submersas a soluções ácidas.

A principal ação dos ácidos que foram utilizados para a submersão das fatias de maçã é a sua capacidade de diminuir o pH do meio, essa ação favorece a inibição da atividade da polifenoloxidase, perdendo sua atividade biológica, a qual tem máxima atividade por volta de pH neutro, O ácido ascórbico, além disso, tem a característica de ser um potente antioxidante que atua reduzindo as ortoquinonas ao fenol anterior, impedindo-as de se polimerizarem formando as melaninas, responsáveis pela coloração amarronzada dos frutos injuriados mecanicamente ou cortados. Já a solução de vinagre que foi utilizada foi o comercial que possui uma acidez mais elevada do que os outros ácidos que estavam diluídos de 1:100, tendo assim maior poder de inibição da polifenoloxidase do que os outros ácidos utilizados.

Experimento 3: Eficiência da aplicação de calor na ativação da Polifenoloxidade.

Na amostra in natura, houve escurecimento já que ela apresentava todas as condições favoráveis para a reação enzimática da Polifenoloxidade: catecol como substrato, presença de oxigênio, e os compostos fenólicos já existentes na amostra.

Na amostra que sofreu tratamento térmico, o esperado era que não fosse observado o escurecimento enzimático, visto que a Polifenoloxidase é sensível á elevadas temperaturas já que ela é termolábil, porém durante o experimento o escurecimento ainda ocorreu, provavelmente porque a temperatura da água em que as fatias de maçã foram submetidas durante 7 minutos estava abaixo da temperatura de desnaturação da enzima, deveria estar fervente, porém estava morna, não inativando a ação da enzima da forma que deveria ser observado, fazendo com que na presença de catecol, o escurecimento ainda ocorreu.

Através dos cálculos da curva de absorbância, observamos que mesmo a maçã sofrendo tratamento térmico, a ação enzima não foi inativada

Curva de Absorbância:

ATIVIDADE ENZIMÁTICA – MAÇÃ IN NATURA

Peso = 1,0401 Valiquota = 0,15 mL ABS (densidade) = 0,02

Passo 1: Aplicando uma regra de três simples para descobrir a quantidade de gramas para o valor da alíquota de 0,15, temos:

1,0401g – 25 mL

x – 0,15 mL x = 0,0062 g

Passo 2: Para descobrir a proporção entre a ABS