RELATÓRIO SOBRE CURVA PADRÃO

RELATÓRIO SOBRE CURVA PADRÃO

1. PRINCÍPIO DO MÉTODO:

A quantidade de proteínas de uma amostra pode ser identificada por meio da técnicado biureto. Essa técnica se baseia na inserção de três reagentes, o tartarato de sódio e potássio, o sulfato de cobre (CuSO4) e a soda cáustica (NaOH) em contato com a proteína.

A soda cáustica serve para desnaturar a proteína, deixando as ligações polipeptídicas expostas. O sulfato de cobre, por sua vez, deve ser hidratado para que dissociado consiga se interagir com as ligações peptídicas. O tartarato de sódio e potássio age na mantença do sulfato de cobre em suspensão e na estabilização das reações que esse deve fazer com as ligações peptídicas

1. OBJETIVO:

O procedimento descrito nesse relatório objetiva a elaboração de uma curva padrão da relação entre quantidade de proteína e a absorbância, assim como o cálculo do fator de calibração e por fim da quantidade total de proteínas de uma amostra a partir de seu valor de absorbância obtido por meio de espectrofotometria.

1. METODOLOGIA:

Para realizar a quantificação de proteínas totais de uma amostra com base em espectrofotometria necessitamos primeiro elaborar uma curva padrão com base na análise de amostras no espectrofotômetro cujas concentrações sejam conhecidas.

Para tanto, amostras de soluções com concentrações maiores ou menores de proteínas (já devidamente marcadas com a técnica do biureto) passam por análise no espectrofotômetro, equipamento capaz de emitir ondas eletromagnéticas em frequências exatas e pré-estabelecidas que passam pela amostra, sendo parte barradas e parte transmitidas, gerando assim valores de absorbância.

As amostras precisam ser feitas com o mínimo erro possível, preferencialmente através do uso de pipetas eletrônicas para dosagem do conteúdo de proteína de cada tubo a ser analisado na espectrofotometria, e com utilização de triplicatas.

As triplicatas objetivam mitigar possíveis inconsistências na pipetagem. Dos três valores gerados descarta-se aquele mais discrepante (se houver) e posteriormente faz-se a média, gerando um valor só de absorbância para cada concentração.

Quanto as concentrações, elas devem ser estabelecidas preferencialmente em intervalos iguais, como vemos na tabela 1, utilizada como base no processo diluição do conteúdo de proteínas entre as amostras a serem utilizadas na elaboração da curva padrão.

Linhas	Concentração d Proteína (μL)	Concentração de Água (μL)
A	0	100
B	25	75
C	50	50
D	75	25
E	100	0

Tabela 1: Concentração de proteína e concentração de água utilizada em cada amostra.

Percebemos o aumento gradativo da concentração de proteínas em cada amostra, assim como o fato de que a primeira amostra (A) não possui nenhum conteúdo de proteína. Essa amostra recebe o nome de branco da reação, tendo como principal função indicar ao aparelho o que não deve ser levado em conta no cálculo da absorbância.

 Como já citado, cada amostra recebeu uma triplicata. Posteriormente foram colocadas em microplacas junto com a amostra do soro do qual objetivamos obter a concentração de proteínas e levadas ao espectrofotômetro regulado na faixa.

Posteriormente, de posse dos valores de absorbância calculamos o fator de calibração individual de cada amostra (exceto a do soro) com base na fórmula Fc = Q / A, em que Fc representa o Fator de Calibração, Q representa a Quantidade de proteína e A a Absorbância.

Fórmula 1: F = Q/A

Os valores de absorbância das amostras individuais são então unidos e através de média simples obtemos o Fator de Calibração médio (FCm). Esse fator pode ser usado na fórmula um para que cheguemos ao valor da quantidade de proteínas do soro (lembrando que desse soro só possuímos o valor de absorbância).

Por fim plotamos o gráfico da curva padrão no software Excel, gerando também o coeficiente de ajuste.

1. RESULTADOS:

Médias das absorbâncias:

B = (0,0485 + 0,0472 + 0,0492) = 0,0483

C = (0,0973 + 0,0913 + 0,0943) = 0,0943

D = (0,1354 + 0,1344 + 0,1374) = 0,1357

E= (0,1816 + 0,1796 + 0,1826) = 0,1813

Padrões	Abs 1	Abs 2	Abs 3	Abs. (média)	Quantidade de albumina em cada poço (mg)	Fc (parcial)	FcM (médio)
B	0,0485	0,0472	0,0492	0,0483	0,1	2,07	2,1425
C	0,0973	0,0913	0,0943	0,0943	0,2	2,12
D	0,1354	0,1344	0,1374	0,1357	0,3	2,21
E	0,1816	0,1796	0,1826	0,18126	0,4	2,17