SEPARAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFIA EM PAPEL

         Universidade Federal de Viçosa – Campus Florestal[pic 1]

Data de Execução: 08/10/2015

      Laboratório de Bioquímica

SEPARAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFIA EM PAPEL

     Professor: Inácio Luduvico

Alunos: Daniela Benevenuto – 1523

Fabiana Carla – 1526

Nathany Leite – 1949

Rosane Pena – 1534

    Waldemar Victor - 1530

Florestal, 10 de outubro de 2015

INTRODUÇÃO

 

A cromatografia é uma técnica de separação baseada na distribuição dos componentes de uma mistura entre um fluido (fase móvel ou eluente) e um adsorvente (fase estacionária). A fase estacionária pode ser um sólido ou um líquido depositado num sólido inerte, empacotado numa coluna ou espalhado por uma superfície formando uma camada fina.

Em papel:

Esta técnica é assim chamada porque utiliza para a separação e identificação das substâncias ou componentes da mistura a migração diferencial sobre a superfície de um papel de filtro de qualidade especial (fase estacionária). A fase móvel pode ser um solvente puro ou uma mistura de solventes.

Este método é muito útil para separar substâncias muito polares, como açúcares e aminoácidos. Possui o inconveniente de poder-se cromatografar poucas quantidades de substância de cada vez.

AMINOÁCIODOS

Os aminoácidos são unidades básicas que constituem as proteínas, que são constituídos por um grupo amina, um grupo carboxila e um grupo R (radical, ou grupo lateral), este faz com que os aminoácidos diferem se em suas estruturas, tamanhos, cargas e influenciam na solubilidade.

Os aminoácidos podem ser classificados em: Apolares ou Polares. Aminoácidos apolares são solúveis em soluções orgânicas, e os Polares em soluções polares. Os aminoácidos polares podem ser negativos ou positivos.

Os aminoácidos que possuem uma cadeia lateral aromática, tendem á insolubilidade em soluções polares, porém, devido ao acréscimo de hidroxilas ou amina, alguns têm caráter hidrófilo.

Tais fatores são importantes para a identificação dos aminoácidos na cromatografia em papel.

OBJETIVO

• Analisação cromatográfica de uma mistura de aminoácidos, usando como padrões aminoácidos conhecidos que são aplicados separadamente em papel, onde sua posição é revelada pela reação com ninidrina.
• Introduzir o conceito de Rf (razão de fluxo) e demonstrar a separação e identificação de aminoácidos através da cromatografia em papel.

MATERIAIS E REAGENTES

• Tubos de ensaio;
• Pipetas;
• Gral e Pistilo refrigerado;
• Centrífuga de bancada;
• Tubos de centrífuga;
• Bastão de vidro;
• Vidro de relógio;
• Béquer e Erlenmeyer;

• Água destilada;
• Fermento biológico;
• Éter etílico;
• Acido tricloroacético (TCA) a 20% e 5%;
• Xilose (pentose padrão);
• Reativo de difenilamina;
• Reativo de Bial.

PROCEDIMENTO

1° Etapa: Preparo do homogeneizado.

• Pesou-se 2,5160 g de um tabiete de fermento biológico num vidro de relógio e o transferiu para um gral para macerá-lo;
• Adicionou-se 5 mL de éter etílico e um pouco de água até formar um homogeneizado;

2° Etapa: Extração dos ácidos nucléicos.

• Em um tudo de ensaio de centrífuga, foi colocado 2 mL do homogeneizado;
• Adicionou-se no tubo 1 mL de TCA a 20%, misturou-o e foi deixado em repouso por 20 minutos;
• Posteriormente, centrifugou-o por 10 minutos, a 5.000 rpm. Desprezou-se o sobrenadante;
• No precipitado, adicionou-se 3 mL de TCA a 5% e ressuspendeu-o utilizando um bastão de vidro;
• Foi transferida a suspensão para um tudo de ensaio pequeno para aquecê-lo em banho-maria por 5 minutos;
• Transferiu-se novamente para um tudo de centrifuga, e centrifugou-o por 5 minutos a 2.500 rpm.
• Por fim, transferiu-se o sobrenadante para um tubo de ensaio e descartou-se o precipitado.

3° Etapa: Reação de identificação dos ácidos nucléicos.

Reação da difenilamina para o DNA.

• Enumerou-se dois tubos de ensaio e transferiu-se, respectivamente, para os tubos 1 mL de água e 1 mL do extrato;
• Acrescentou-se aos tubos 1 mL do reativo de difenilamina e homogeneizou-o;
• Ao final, foi levado ao banho-maria fervente por alguns minutos ate observar o aparecimento da coloração.

Reação de Bial para RNA.

• Enumerou-se tres tubos de ensaio e transferiu-se, respectivamente, para os tubos 1 mL de água, 1 mL de Xilose (padrão) e 1 mL do extrato;
• Acrescentou-se aos tubos 1 mL do reativo de Bial e homogeneizou-o;
• Ao final, foi levado ao banho-maria fervente por alguns minutos ate observar o aparecimento da coloração.

RESULTADOS e discussão

1° Etapa: No preparo do homogeneizado, primeiramente macerou-se o fermento biológico com a finalidade de aumentar a superfície de contato e proporcionar uma melhor interação com o éter etílico e a água.  Depois foi adicionado Éter etílico que é uma molécula muito pouco polar logo, ele ira interagir com o lipídio que também é muito pouco polar e isso promoverá o rompimento das membranas celulares pela desnaturação da bicamada lipídica. Foi adicionado um pouco de água destilada para ajudar na formação do homogeneizado e para interagir com as moléculas polares presentes no fermento biológico como carboidratos, sais e etc.

2° Etapa: Nessa etapa, foi colocado em um pouco do homogeneizado TCA 20% que é um ácido que disponibiliza muitos prótons e como as proteínas possuem muitos sítios básicos (grupamento amina) que são capazes de capturar prótons, a estrutura ira desnaturar, quebrando as interações do tipo Ligação de Hidrogênio e diminuindo a solubilidade das proteínas, ou seja, elas irão precipitar. Depois disso, o nosso produto foi colocado na centrifuga para acelerar o processo de separação das fases (precipitado e sobrenadante). Esse procedimento é importante porque quando o TCA 20% é adicionado ele promovera a desnaturação no meio e as proteínas irão precipitar, logo teremos duas fases que continham:                                                                          Precipitado: Enzimas, ácidos nucléicos e proteínas;                                       Sobrenadante: Éter etílico, Lipídeos, água, sais e etc.                                        Logo, como nossa finalidade é extração dos ácidos nucléicos, e ele estava presente no precipitado, o sobrenadante foi descartado porque ele continha substâncias que não eram necessárias para o estudo em especifico.                 Após esse processo foi adicionado TCA 5% que também possui finalidade de desnaturar o meio e formar precipitado. E como as enzimas e proteínas possuem caráter mais básico que os ácidos nucléicos elas irão capturar os prótons (protonar) diminuindo a solubilidade e precipitando. A adição de TCA 5% desnatura apenas as enzimas e proteínas porque eles possuem Hidrogênios mais disponíveis que no caso dos ácidos nucléicos onde os Hidrogênios estão envolvidos na ressonância, logo não conseguem capturar os prótons e desnaturar. O produto também foi colocado na centrifuga para acelerar o processo de separação das fases (precipitado e sobrenadante). Depois de centrifugado tínhamos:                                                      Precipitado: Enzimas e proteínas;                                                           Sobrenadante: Ácidos nucléicos.                                                                        Assim, o precipitado foi descartado porque o nosso produto de interesse é o Ácido nucléico.

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