A Biologia Molecular

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   Centro de Ciências Biológicas e da Saúde

Departamento de Biologia

Campus I – Campina Grande

Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas

Componente Curricular: Biologia Molecular

Professor (a): Walclécio Morais Lira

ELETROFORESE

RENATA MYLLENA FIGUEIREDO TAVARES

Campina Grande – Paraíba

20 de setembro de 2017

Sendo uma técnica baseada na separação e purificação de partículas ou macromoléculas como ácidos nucléicos e proteínas, a eletroforese ocorre quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas em um eletrólito que consiste numa substancia que, se dissociada ou ionizada, pode originar íons positivos e negativos, pela adição de um solvente ou por aquecimento, fazendo com que se torne um condutor de eletricidade. Devido a isso, nessa técnica ocorre a migração de moléculas ionizadas de acordo com suas cargas elétricas e pesos moleculares principalmente, em campo elétrico. Sendo assim, moléculas com carga negativa migram para o polo positivo (ânodo) e moléculas com carga positiva migram para o polo negativo (cátodo).

Existem três tipos principais de eletroforese, a em gel, a desnaturante e a capilar. A eletroforese em gel consiste na separação de moléculas onde as partículas são carregadas negativamente por um composto chamado de SDS (detergente dodecil sulfato de sódio). Ocorre dentro de uma matriz ou gel que possibilita a corrida da amostra. Esse gel é introduzido dentro de uma solução tampão específica que fornece as condições ideais para a passagem da corrente e a manutenção do valor do pH. Posteriormente as amostras são pipetadas em pequenos poços feitos com um pente no gel. Para ocorrer a migração, a cuba e a fonte de eletroforese exercem uma voltagem, corrente e potência constantes. Finalmente as bandas são visualizadas sob a luz ultravioleta ou LED, através do transiluminador. Nesta técnica de eletroforese podem ser utilizados dois tipos de gel, a agarose que é um polissacarídeo, formando uma rede que prende as moléculas durante a migração. Dependendo da concentração de agarose, pode haver uma diferença no gradiente de separação. A agarose é extraída de algas marinhas, sendo extremamente fácil de preparar, pois basta misturar o pó de agarose com solução tampão TBE; após fundir, coloca-se brometo de etídio, que fará o DNA ou RNA “brilhar” quando exposto ao UV. O outro tipo de gel utilizado na eletroforese é o de policrilamida que é uma mistura de dois polímeros, a acrilamida e a bisacrilamida. A primeira é uma molécula linear, enquanto que a bisacrilamida tem forma de T, quando se faz a mistura dos dois, ocorre a formação de uma rede que tem a capacidade de separar pequenos fragmentos de DNA e que apresentam uma mínima diferença e massa, além disso o gel pode recuperar e purificar determinada amostra. Diferentes concentrações dessas moléculas permitem a criação de diferentes gradientes de separação. Para preparar o gel, devem-se misturar as duas substâncias em determinadas concentrações, e colocá-las em um suporte de vidro, adicionando Temed e S208, que atuam catalisadores da polimerização. Contudo, o gel de agarose é mais utilizado, pois a poliacrilamida é muito tóxica e difícil de ser preparada e neste tipo de gel a corrida é feita em cubas verticais, e o carante utilizado é o mesmo da eletroforese em gel de agarose.

Existem ainda dois tipos de gel de poliacrilamida, o desnaturante (SDS-PAGE) e o não desnaturante (nativa). O primeiro faz a separação por peso molecular das fitas simples de DNA que apresentam diferenciação em suas estruturas secundárias. Faz também a purificação dessas fitas e convenciona desnaturante, pois é polimerizado pela uréia. Esse tipo de desnaturante pode ser ainda redutor e não-redutor, permitindo observar a presença de dímeros e outras proteínas contendo pontes de disulfeto. Já o gel não desnaturante faz a separação por cargas, peso molecular e forma, purificando também fitas duplas de DNA.

Um outro tipo de eletroforese é a capilar que consiste num transporte em solução eletrolítica de compostos carregados eletricamente sob a influência de um campo elétrico, onde a separação entre dois solutos ocorre de acordo com as diferenças entre suas mobilidades eletroforéticas. Funciona como a eletroforese normal, porém o gel e a amostra estão dentro de um tubo capilar preenchido por um eletrólito tendo como principal vantagem o uso de capilares com diâmetros internos extremamente pequenos, permitindo assim uma melhor dissipação do calor e obtendo uma alta eficiência de separação com tempo reduzido de análise. Este processo é utilizado em sequenciadores de DNA. Uma característica que difere a eletroforese capilar das demais é sua capacidade única de separar macromoléculas carregadas eletricamente. E além disso é uma técnica aplicável na determinação de uma grande variedade de amostras, incluindo hidrocarbonetos aromáticos, vitaminas hidrossolúveis e lipossolúveis, aminoácidos, ácidos orgânicos, fármacos, entre outros.

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