ANÁLISE BACTERIOLÓGICA ATRAVÉS DA TÉCNICA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL PELOS TUBOS MÚLTIPLOS (NMP)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

FACULDADE DE ARQUITETURA, ENGENHARIA E TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA SANITÁRIA E AMBIENTAL

ENGENHARIA SANITÁRIA E AMBIENTAL

GABRIELA RIBEIRO BEZERRA

GLEYCIANE APARECIDA FABIAN

ANÁLISE BACTERIOLÓGICA ATRAVÉS DA TÉCNICA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL PELOS TUBOS MÚLTIPLOS (NMP)

CUIABÁ-MT

2015

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

FACULDADE DE ARQUITETURA, ENGENHARIA E TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA SANITÁRIA E AMBIENTAL

ENGENHARIA SANITÁRIA E AMBIENTAL

GABRIELA RIBEIRO BEZERRA

GLEYCIANE APARECIDA FABIAN

ANÁLISE BACTERIOLÓGICA ATRAVÉS DA TÉCNICA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL PELOS TUBOS MÚLTIPLOS (NMP)

Relatório apresentado à Universidade Federal de Mato Grosso, curso de Engenharia Sanitária e Ambiental, como parte dos requisitos necessários para obtenção de nota da disciplina de Microbiologia Geral, sob a orientação da Prof. Dra. Danila Soares Caixeta.

CUIABÁ-MT

2015

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO...........................................................................................................04

OBJETIVOS...............................................................................................................05

MATERIAIS E MÉTODOS.........................................................................................06

RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................09

CONCLUSÃO.............................................................................................................12

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................13

ANEXOS....................................................................................................................14

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INTRODUÇÃO

As águas superficiais são estudadas pela Hidrologia e constituem base para a existência de vida no planeta terra. A partir disso, constata-se a importância da preservação e manutenção da qualidade das águas disponíveis em superfície. Assim, fez-se necessário a criação de normas ambientais para a proteção dos recursos hídricos que podem ser superficiais ou subterrâneos.

O Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) determina, atualmente, os parâmetros de qualidade das águas superficiais com a resolução número 357 de 17 de março de 2005. Assim, o artigo dois do capitulo um define para efeitos da resolução, dentre elas: I – Águas doces, águas com salinidade igual ou inferior a 0,5; IV - ambiente lêntico: ambiente que se refere à água parada, com movimento lento ou estagnado. Ademais, a sua classificação depende do uso o qual ela será destinada.

Os principais indicadores de contaminação estão os coliformes totais, E.Coli e estreptococos fecais, para determinar esses microrganismos e muito utilizados hoje em dia o Método do Número mais Provável (MNP), a técnica utilizada também e conhecida por Tubos Múltiplos.

O Método Tubos Múltiplos e divididos em duas fases, presuntiva sobre a população real de coliformes total e confirmativa a população de coliformes termotolerantes de origem fecal, a analise e feita para o controle da qualidade da água.

O teste presuntivo consiste na distribuição asséptica de porções múltiplas de 1 mL da amostra em tubos de ensaio contendo caldo lactosado e tubos de Durham invertidos, seguida de incubação a 35 ± 0,5 ºC por 24-48 horas . A produção de gás é considerada como teste presuntivo positivo, presuntivo porque muitos outros germes podem produzir gás neste meio de cultura, Portanto a produção de gás não é prova da existência de coliformes na água.

O teste confirmativo consiste na transferência de todos os tubos de caldo lactosado, 24-48 h, a 35 ± 0,5 ºC, para tubos contendo caldo lactosado e 2% de bile verde brilhante ou para uma placa de Petri contendo meio Agar Eosina Azul de Metileno (EAM) e incubação a 35 ºC por 48 e 24 h respectivamente. A produção de gás nos tubos ou o aparecimento de colônias típicas de coliformes nas placas confirma a presença de coliformes.

OBJETIVOS

         O presente teste de análises bacteriológicas teve como principal objetivo verificar se há presença de Coliformes Totais, Coliformes Termo Tolerantes e E,Coli, no canal de captação de água fluvial que fica na entrada  do bloco de Engenharia Sanitária e Ambiental da UFMT, do Campus de Cuiabá, a técnica utilizada será pelos Tubos Múltiplos ( Método do Número mais Provável).

MATERIAIS E MÉTODOS

MATERIAIS            

• Amostra de água bruta
• Para a pesquisa de termotolerantes é necessário o caldo EC-MUG (suplementado com 4-metilumbeliferil-β-Dglicuronídeo), que também é um meio seletivo, somente permitindo o crescimento das bactérias de origem fecal que sobrevive a 44,5°C.
• Equipamentos e vidrarias 
• Estufa bacteriológica - crescimento a 35-37°C.
• Banho Maria - crescimento de termotolerantes a 44,5°C
• Alça bacteriológica de platina - para transferir alçadas de um tubo a outro.

• Tubos de ensaio contendo meio Caldo Lactosado com púrpura de Bromocresol.
• Tubos de ensaio contendo Caldo Lactosado Verde Brilhante Bile a 2%
• Tubos de Durham - observar a presença/captação de gás.
• Pipetas estéreis.
• Luz ultravioleta.
• Bico de Bunsen.

MÉTODOS

TESTE PRESUNTIVO

• Identificou-se 15 tubos, contendo caldo lactosado com púrpura de bromocresol (CL_PBC), com o volume da diluição da amostra a ser inoculada e foi colocado em uma grade, em fileiras de 5 tubos.
• Em seguida homogeinizou-se a ámostra , com uma pipeta de 10mL, transferiu-se 10mL da amostra para um frasco contendo 90mL de água de diluição tamponada, antecipadamente identificado.
• Preparou-se assim a primeira diluição decimal (10-1 ), sendo que 1 mL da mesma corresponde a 0,1 mL da amostra. Em seguida desprezou-se a pipeta de 10mL e, com uma pipeta de 5 mL, inoculou-se 1mL da amostra em cada um dos 5 tubos correspondentes a quantidade de inóculo.
• Homogeinizou-se a amostra com a primiera diluição (10-1 )  agitou-se vigorosamente o frasco e, com uma nova pipeta, trasferiu-se 10mL para um frasco contendo 90mL de água de diluição tamponada, dessa forma foi realizada a segunda diluição decimal (10-2 ), sendo que 1mL da mesma corresponde a 0,01 mL da amostra.
• Desta forma foi feito até a terceira diluição (10-3). Após foi realizada a inoculação de todos os volumes das amostras e das diluições requeridas e colocados na grade contendo os tubos inoculados em incubadora a 37ºC, durante 24hs.
• Depois desse periodo de incubação , foi efetuada a primeira leitura de resultados, onde retirou-se os tubos com resultado positivo (produção de gás) e anotou-se os resultados.
• Os tubos com resultado negativo voltou para a incubadora para ficar por mais um período de 24hs. Passando o período de 48hs foi feita a segunda leitura, os tubos com resultado positivo foram separados, e os negativos descartados.

TESTE CONFIRMATIVO

       A seguir para realizar o ensaio confirmativo, , pegou-se todos os tubos com rsultado positivo em caldo lactosado com púrpura de bromocresol (CL-PBC) nas leituras de 24 e 48 horas, e foram submetidos á confirmação imediatamente após as leituras.

• Primeiro identificamos os tubos contendo caldo lactosado verde brilhante a bile a 2% (CLVBB) correspondentes a cada tubo de CL-PBC com resultado presuntivo positivo;
• Foram agitados os tubos de CL-PBC um a um, e com uma alça de olatina fizemos a inoculaçao do tubo CLVBB correspondente, foi tomado o cuidado para preservar a película superficial, evitando a formação do CL-PBC presuntivo positivo;
• Em seguida os tubos foram incubados por 48 horas, á 37ºC;
• Após esse período foi realizada a leitura, considerando como teste confirmativo positivo todos os tubos que apresentaram formação de gás e turvação do meio;
• Anotou-se os resultados para realizar o cálculo do NMP a partir dos dados obtidos.

DETERMINAÇÃO DE Escherichia coli

Foi realizada a paritir dos tubos positivos de CL-PBC.

• Foi realizada a marcação dos tubos que continham meio EC-MUG (previamente mantidos em banho-maria a 44,5 ± 0,2ºC durante um período mínimo de 30 min) com os números correspondengtes a cada tubo CL-PBC positivo;
• Dando continuidade agitamos bem cada um dos tubos e com auxilio de uma alça de semeadura, inoculamos o tubo EC-MUG correspodente, tomando cuidado para não romper a película superficial que pode se formar na cultura presuntiva positiva;
• Em seguida incubamos os tubos EC-MUG inculados, em no máx 30min após esse período de inoculação, em seguida colocados em banho-maria 44,5 ± 0,2ºC por 24hs;
• Foi dado o prosseguimento na leitura, pegamos os tubos e colocamos sob luz ultravioleta (lâmpada 3 a 6w, ondas longas de 365nm), foram considerados como positivos os tubos que apresentaram fluorescência azul.

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RESULTADO E DISCURSÃO

Após a realização de técnica dos tubos múltiplos, foi realizada á leitura dos tubos, de acordo com o período de 24 e 48 horas.   Notou-se que foi identificada a presença de coliformes termotolerantes com base nas leituras. Com isso, utilizamos os resultados para saber o Número mais Provável (NMP) de coliformes em 100 ml de água, seguindo a tabela de NMP de coliformes, ou estimando pela fórmula de Thomas: