Azarime e sua atividade

Efeito hepatoprotetor de Arazyme em lesão hepática aguda induzida por CCl4 em (senescence marker protein 30) SMP30 camundongos knock-out.

Resumo

        Arazyme é uma nova protease produzida pelo genero HY-3 de Aranicola proteolyticus, que é uma bactéria aeróbica Gram-negativa, que tem sido isolada a partir do intestino da aranha Nephila clavata. Este estudo focou os efeitos hepatoprotetores de Arazyme em tetracloreto de carbono em lesão hepática aguda (CCI4)-induzida em *SMP30 knock-out (KO) e SMP30 wild-type (WT). (*São dois tipos de camundongos). Os dois tipos de camundongos (WT e SMP30 KO) foram divididos em oito grupos como se segue: (i) dois grupos de controle negativo (G1, G5), que foram tratados com uma única injeção intraperitoneal (i.p.) de óleo de oliva. (ii) Dois grupos de controle positivo (G2, G6), que receberam uma única injeção (i.p) de CCl4 a (0.4 mL / kg). (iii) Dois grupos foram tratados com vitamina C (G3, G7) que receberam uma única administração oral de vitamina C (100 mg/kg) e foram injetados  uma única i.p. de CCl4 (0.4 mL/kg). (iv) Dois grupos tratados com Arazyme (G4 e G8) que receberam uma única administração oral de Arazyme (500 mg/kg) e foram injetados com uma única i.p. CCl4 (0.4 mL / kg). Através do presente estudo, poderíamos achar que os grupos tratados com Arazyme, apresentaram diminuição no grau de lesão hepática, aumento da expressão de SMP30, diminuição da expressão de phosfo-Smad3 (p-Smad3), elevada expressão de proteínas antioxidantes, incluindo sorbitol desidrogenase, dihydropteridine redutase (DHPR), desidrof redutase (DHFR), o NADH desidrogenase, glutationa-S-transferase kappa-1 (GSTK1) e hidroperóxido de fosfolípido glutationa peroxidase (PHGPx), em comparação com grupos não tratados com Arazyme. Portanto, conclui-se que Arazyme desempenha um papel significativo na proteção dos hepatócitos lesados através do aumento da expressão de SMP30, inibindo o fator de crescimento transformante ß (TGF-ß)/Smad via de elevação e a expressão de proteínas antioxidantes.

1. Introdução

A lesão hepática pode ser induzida por vários fatores e hepatotoxinas tais como CCI4, etanol e acetaminofeno (paracetamol) que são metabolizados pelo citocromo P450 2E1 (CYP2E1). Radicais livres instáveis e espécies reativas de oxigênio (ROS) são gerados por esta via metabólica (Kuzu et al., 2007) e esses radicais livres e ROS induzem a apoptose das células do fígado à necrose. O ROS e radicais livres induzem uma regulação-positiva do fator de necrose tumoral-alfa (TNF-∂), interleucina-10 (IL-10) e fator de crescimento transformante-beta (TGF-ß) em hepatócitos necróticos. Estes aumentos de citocinas aceleram a progressão da lesão hepática de fase aguda para doença hepática crônica. Muitos estudos anteriores têm relatado que o SMP30, um importante 34-kDa molécula marcadora de envelhecimento originalmente identificadas a partir de fígados de ratos, é notável pela diminuição de androgen-independent nos fígados de ratos envelhecidos (Fujita et al., 1992). O SMP30 mantém a homeostase do cálcio (Fujita, 1999) e tem atividade gluconolactonase (GNL), que é envolvida na biossíntese de ácido L-ascórbico (vitamina C) (Kondo et al., 2006). Em resultado da capacidade sequestrante da vitamina C de radicais livres, que é capaz de funcionar como um poderoso antioxidante para lesões agudas ou crônicas de tecidos e lesões de órgãos (Buettner, 1993; Buettner e Jurkiewicz, 1996). Portanto, o SMP30 impede a apoptose e necrose de hepatócitos por manutenção da homeostase do cálcio e a biossíntese de vitamina C como um antioxidante poderoso nos hepatócitos. No entanto, o SMP30 mostra uma diminuição de androgen-independent com a idade e a expressão de SMP30 também diminui devido a lesão do fígado causada por lipopolissacarídeo (LPS)-induzido, por ROS, a administração de CCI4, e tratamento 3,3,5-triiodo-L-tironina (T3) (Sar et al., 2007). A diminuição da expressão de SMP30 no envelhecimento e na lesão de órgãos tais como o fígado, facilita a apoptose das células à necrose (Ishigami et al., 2002). Muitos estudos recentes mostraram que as ROS são fatores cruciais na patogénese de doenças do fígado, incluindo a hepatite viral, hepatite alcoólica, lesão hepática isquêmica e toxicidade de drogas (Albano, 2002; Pessayre, 1995). Muitos antioxidantes têm sido propostos para utilização na prevenção de lesão hepática aguda tóxica, mas a maioria dos antioxidantes não mostram efeitos protetores suficientes para lesão hepática aguda (Wu et al., 2007). Muitos estudos têm relatado que vários medicamentos fitoterápicos tradicionais têm um efeito protetor contra a lesão induzida por ROS. No entanto, as substâncias, tais como aquelas a partir de extrato de insetos não têm sido suficientemente estudado para determinar seus efeitos protetores contra lesões hepáticas. Arazyme é uma nova 51.5-kDa  metaloprotease que é secretada no meio de cultura por o microorganismo Aranicola proteolyticus denominada atualmente como Serratia proteamaculans, uma bactéria simbiótica Gram-negativa aeróbia isolada a partir do intestino da aranha Nephila clavata (Bersanettia et ai, 2005;. Kwak et al., 2007). Este estudo é focado em examinar os efeitos da administração oral de Arazyme produzida pela linhagem HY-3 de A. proteolyticus, em comparação com a vitamina C, sobre lesão hepática aguda induzida por CCl4 em SMP30 knock-out (KO) e camundongos wild-type (WT).

1. Materiais e métodos

1. Animais e desenho experimental

Com 12 semanas de idade, do sexo masculino, patógeno específico livre, os camundongos SMP30 KO (n = 20) e camundongos WT (n = 20) pesando 23-25 g foram utilizados neste estudo. Os camundongos WT foram adquiridos pela Japan SLC, Inc. e mantidos durante 1 semana antes da utilização experimental. Os camundongos SMP30 KO composto por 10 camundongos machos e 20 camundongos fêmeas foram obtidos a partir de Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology e alojados em um quarto em 22º ± 3º ºC, umidade relativa de 50% ± 10%, em ciclo claro-escuro de 12h e foram dado alimento e água a libitum (à vontade). Os camundongos SMP30 KO foram criados e a primeira geração de camundongos machos SMP30 KO foram utilizados neste estudo. O DNA genómico dos camundongos SMP30 KO foi purificado a partir de tecido da cauda do camundongo, utilizando uma combinação de vários procedimentos de acordo com a literatura (Henneberger et al., 2000). Os genótipos foram determinados por PCR utilizando o iniciador TA4 (5-CAAGTAACTCTAGGTATGGAC-3), TS3 (5-CTAGCCATGGTGGATGAAGAT-3) e NEO (5 -TCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATT-3) para detectar o alelo SMP30 normal. As experiências em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes de NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório. Cada um dos camundongos WT e SMP30 KO foram divididos em quatro grupos. As 24 horas após a injeção de CCI4, todos os animais foram sacrificados. Estes grupos e o desenho experimental são esquematicamente mostrados na Fig.1. A dose de CCl4 foi determinada de acordo com a literatura (Huang et al., 1995) e a determinação da dose de vitamina C foi realizada de acordo com um estudo anterior (Kondo et al., 2006).

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