Determinação da atividade da pectina-liase

Determinação da atividade de pectina-liase

Para a determinação da atividade da pectina-liase, a mistura de reação constou de 0,5mL de solução-tampão Tris/HCl 0,2M pH 8.5 contendo 1% de pectina com 64-72% de esterificação e 0.5mL da solução enzimática bruta extraída, a 55oC por 30 minutos. Interrompeu-se a reação com 10mL HCl 0,2N e efetuou-se a leitura a 235nm, segundo o método de Albersheim (1996). Uma Determinação de atividade proteolítica

Para algumas condições do experimento, foi avaliada a atividade de protease pela técnica da Azocaseína proposta por Leighton et al. (1973). Em 250 uL de uma solução 1% de azocaseína em tampão fosfato pH 8,0 e 0,2M, adicionou-se 150 uL de extrato enzimático, incubando-se a 37°C por 30 minutos. A reação foi paralisada com 1,0 mL de ácido tricloroacético a 10%. Após centrifugação da amostra a 10.000 rpm por 10 minutos, adicionou-se 1,4 mL de uma solução de NaOH a 1,2 mL de sobrenadante obtido. A leitura foi realizada em 440 nm. Uma unidade de atividade enzimática é a quantidade de enzima que produz a alteração em uma unidade de leitura por minuto nas condições do método proposto.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nos cultivos com A. awamori, foi observada uma alta atividade de pectina-liase em 39 horas de cultivo (1548 U/mL), quando o substrato utilizado era composto de 70% de bagaço de laranja, hidratado com 15 mL de água e cultivado a 33ºC, estando, porém, abaixo do obtido por Martins et al. (2002), cujo fungo termofílico Thermoascus aurantiacus obteve uma alta atividade enzimática em meio composto por 90% de bagaço de laranja (5000 U/mL). Contudo, os resultados obtidos foram bastante superiores aos de Acuña-Argüelles et al. (1995) cuja maior atividade enzimática foi de 70U/mL após 2 dias de fermentação (Tabela 3).

Tabela 3: Determinação da atividade da pectina-liase produzida por A. awamori (tratamento = teor de bagaço de laranja / quantidade de água / temperatura)

39h 43h 48h 52h

Tratamento U/ml U/ml U/ml U/ml

80/10/37 36,02 678,11 1398,60 84,76

80/20/37 968,00 104,26 974,78 805,25

80/10/28 0,00 0,00 1440,98 1525,75

80/20/28 127,15 336,09 1271,45 1059,55

60/10/37 953,17 823,90 508,58 1144,31

60/20/37 0,00 219,11 974,78 1017,16

60/10/28 575,97 933,25 1186,69 508,58

60/20/28 42,81 217,84 974,78 1144,31

70/15/33 322,53 0,00 847,64 932,40

70/15/33 1548,21 459,42 1017,16 1186,69

70/15/33 42,38 0,00 805,25 169,53

Os valores obtidos para a pectina liase produzida pelo Penicillium viridicatum não estão indicados pois os resultados mostraram uma atividade insignificante.

A amilase produzida por Aspergillus awamori apresentou máxima produção a 39 horas de cultivo com 31,78 U/mL quando o microrganismo foi cultivado no meio contendo 60% de bagaço de laranja e 40% de farelo de arroz, 20mL de umidade e a 28ºC (tab. 4).

A atividade amilolítica mostrou-se influenciada pela ação da composição do meio de cultivo onde a maior concentração de arroz (40%) levou possivelmente a indução na síntese da enzima enquanto que a diminuição da quantidade de farelo de arroz e o aumento da concentração do bagaço de laranja promoveu a produção da pectina-liase ao longo do período fermentativo. A umidade demonstrou exercer influência na síntese das enzimas: quanto menor a umidade, maior a capacidade da síntese.

Tabela 4 : Determinação da atividade Amilásica produzida pelo Aspergillus awamori

39 h 43h 48h 52h

Tratamentos U/mL U/mL U/mL U/mL

80/10/37 19,53 9,58 11,4 5,3

80/20/37 22,2 17,18 11,13 3,29

80/10/28 17,54 23,29 14,32 5,66