Diversidade de Sistemas Imunológicos CRISPR-Cas e Máquinas Moleculares

Diversidade de sistemas imunológicos CRISPR-Cas e máquinas moleculares

Barrangou R.

A caracterização dos processos biológicos subjacentes à imunidade adaptativa baseada em CRISPR em bactérias e archaea deu forma a muitos aspectos cruciais da década passada nos campos da microbiologia e da genética, e permitiu a atual mania de "edição do genoma" [1]. O CRISPR-Cas é um sistema imunológico (Fig. 1), que fornece imunidade adaptativa contra elementos invasivos como vírus e plasmídeos em bactérias e archaea [2- 5]. Embora os loci CRISPR foram observados pela primeira vez no genoma de Escherichia coli em 1987 [6], levou 15 anos de genômica microbiana renaissance para apreciar a sua ocorrência generalizada em bactérias e arqueas [7, 8]. Na verdade, foi exatamente 10 anos atrás que surgiu a primeira pista funcional, com a observação de que os espaçadores CRISPR mostraram homologia com sequências virais [9-11], levando à hipótese de que eles poderiam constituir um equivalente procariótico à interferência de RNA (RNAi) 12]. Pouco depois, sua função biológica como sistema imunológico adaptativo foi estabelecida [13], revelando que as matrizes CRISPR, juntamente com os genes cas, fornecem imunidade adquirida contra bacteriófagos de uma forma específica da sequência. O mecanismo de ação de vários sistemas CRISPR-Cas foi determinado através de descobertas de marco que estabelecem que a imunidade codificada por CRISPR é mediada pelo ARN CRISPR (CrRNAs) [14], e alvos de DNA invasivo [15] e às vezes RNA [16].

As principais descobertas estabeleceram rapidamente que o direcionamento é geralmente dependente de uma sequência curta de DNA conhecida como o motivo adjacente ao protospacer (PAM) [17-19], é movido por sequências de sementes [20, 21] e é mediado por endonucleases Cas que clivam especificamente o DNA complementar [22]. Para os sistemas tipo I, os esforços iniciais definiram os fundamentos bioquímicos e estruturais do "complexo associado ao CRISPR para defesa antiviral" (Cascade) [14] e a degradação endonucleolítica e exonucleolítica do DNA por Cas3 [23-29]. Para os sistemas de tipo II, os estudos iniciais definiram a biogênese do CRRNA [30], a imunidade dependente de Cas9 [13] ea clivagem [22] e, eventualmente, a programação reprogramável [31] ea gênese de rupturas precisas de ADN de cadeia dupla (dsDNA) -34].

Provavelmente, foi o giro dos sistemas CRISPR-Cas nativos em sistemas de dois componentes engenheira dos e programáveis ​​que compreendem Cas9 e RNAs de guia único (sgRNAs) [33], que foi o ponto de inflexão tecnológico que permitiu sozinho a edição de genoma controlada por Cas9 [35-37 ] E alimentou a mania de CRISPR que desdobrou-se sem parar desde então [1, 38]. O tour de force técnico transformou essencialmente o sistema de quatro componentes de ARN CRISPR (tracrRNA) -crRNA-RNase-III nativo na tecnologia de Cas9-sgRNA simplificada, tornando o desafio de cooptar o sistema para aplicações eucarióticas acessíveis . A gênese sintética dos sgRNAs permitiu a reorientação do sistema imunológico CRISPR-Cas em máquinas moleculares poderosas e ágeis que podem produzir rupturas de cadeia dupla. Na verdade, a mania de edição do genoma baseado no bisturi molecular Cas9 foi prefigurada no outono de 2012 [39], após o lançamento da tecnologia sgRNA-Cas9, e precedendo a publicação da prova de conceito em humanos [35, 36] Células [37]. Em poucos meses, os laboratórios da Igreja, Zhang e Marraffini conseguiram estabelecer simultaneamente que a tecnologia sgRNA-Cas9 pode ser explorada para a edição eficiente do genoma, e imediatamente depois disso, centenas de estudos mostraram que essa abordagem pode ser implementada universalmente em uma ampla gama de células E organismos modelo. A avalanche de estudos de edição de genomas baseados em Cas9 atesta o potencial dessa tecnologia amplamente aplicável.

Mecanicamente, a imunidade CRISPR-Cas articula-se em três etapas distintas, definidas como adaptação, expressão e interferência (Fig. 1). Na fase de adaptação, a imunização com CRISPR ocorre através da absorção e integração polarizada de DNA invasivo como um novo espaçador CRISPR na matriz CRISPR, criando um registro seriado de eventos de vacinação. Na fase de expressão, a matriz CRISPR é transcrita num transcrito de ARN pre-CRISPR completo (pré-CRRNA) que é processado em ARNc maduros contendo sequências espaçadoras CRISPR parciais ligadas a repetições CRISPR parciais, formando RNAs de guia CRISPR. No estádio de interferência, os CRRNAs dirigem as nucleases de Cas para ácidos nucleicos complementares para a segmentação específica de sequência e clivagem de elementos genéticos invasivos. A maioria das proteínas efectoras CRISPR inicia o direcionamento por interação com um motivo de seqüência de dois a quatro nucleotídeos, o PAM. Uma vez que a interacção com a PAM foi estabelecida, a guia de CRRNA carregada dentro da nuclease de Cas pode então interrogar o ADN flanqueador alvo [40, 41]. A força ea duração da interação molecular correlacionam-se com o nível de complementaridade entre o CRRNA e o DNA alvo, que impulsiona mudanças conformacionais em proteínas efectoras de Cas, como Cas9 [40, 42, 43] e Cascade [44-46], que eventualmente Levar a um estado estrutural cleavage-competente [40]. Se a complementaridade entre o ARN guia e o ADN alvo se estende para além da sequência de semente, um anel R de ADN é formado direccionalmente [29, 47, 48], o que desencadeia o entalhamento subsequente pelas nucleases efectoras Cas (isto é Cas3, Cas9, Cpf1) a Locais definidos por um mecanismo de âncora de régua. A literatura inclui muitas revisões que cobrem a história [49-52], biologia [3-5, 53-56] e aplicações [57-63] de CRISPR-Cas sistemas.

Em termos gerais, existem duas classes principais de sistemas CRISPR-Cas, que englobam cinco tipos principais e 16 subtipos diferentes baseados no conteúdo do gene cas, na arquitetura do operão cas, nas sequências de proteína Cas e nos processos subjacentes aos passos acima mencionados (Fig. 1) [65, 66]. A primeira classe é definida por complexos efetores multiprotéicos (Cascade, Cmr, Csm), e engloba os tipos I, III e IV. Em particular, os sistemas de tipo I são os sistemas mais frequentes e mais difundidos, que direccionam o ADN de uma forma dependente de cascata e PAM, destruindo os ácidos nucleicos alvo utilizando a proteína de assinatura Cas3 [26, 28, 67-71] (Fig. 2). Muitos estudos têm levado a uma extensa caracterização bioquímica e estrutural das proteínas efetoras e dos complexos proteína-DNA-ARN implicados nos sistemas CRISPR-Cas tipo I [20, 23, 24, 46, 72-77]. Do mesmo modo, os sistemas de tipo III ocorrem com freqüência em archaea e são caracterizados pelos complexos multiprotéicos Csm [78-82] ou Cmr [16, 83-95]; Eles operam de uma maneira independente de PAM e podem clivar DNA ou ARN usando a proteína Cas10 de assinatura juntamente com nucleases efetoras tais como Cmr4 (a RNase dentro do complexo Cmr para sistemas do tipo III-B) [85, 95] e Csm3 RNase dentro do complexo Csm para sistemas do tipo III-A) [81, 82]. Curiosamente, vários estudos recentes revelaram que o tipo III CRISPR-Cas sistemas podem realmente alvo ambos os ácidos nucleicos tipos, através de co-transcrição ARN e DNA clivagem [80, 82]. Especificamente, sítios activos distintos dentro do complexo efector de ribonucleoproteína Cas10-Csm dirigem clivagem de ADN guiada por ARN co-transcricional e clivagem de ARN [80]. Os sistemas de tipo IV são bastante raros e ainda permanecem para serem caracterizados em termos de sua distribuição e função.