Extração De DNA

Protocolos

Isolamento de DNA total de plantas utilizando-se o método CTAB

1. Pese 3 g do material vegetal a ser analisado (calos, folhas, plântulas etc.), de preferência fresco, e transfira para um almofariz contendo com nitrogênio líquido. Com o auxílio de um pilão, pulverize o material até se obter um pó fino.

2. Transfira rapidamente o pó obtido para um tubo de polipropileno de 50 ml que contenha 15 ml de tampão CTAB [CTAB 2% (p/v); NaCl 1,4 M; Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; EDTA 20 mM; b-mercaptoetanol 0,2% (v/v)] pré-aquecido a 65oC. Feche o tubo e misture gentilmente até o pó ficar homogeneamente distribuído.

3. Incube as amostras em banho-maria a 60oC por 30 minutos, agitando ocasionalmente o tubo para manter o extrato ressuspendido.

4. Retire o tubo do banho-maria e espere que a mistura atinja a temperatura ambiente. Adicione 15 ml de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1; v/v). Feche o tubo e misture manualmente por 10 minutos.

5. Centrifugue a 5.000 g por 10 minutos a temperatura ambiente, para separar a fase orgânica da aquosa.

6. Remova a fase aquosa (fase superior) para um tubo novo de 50 ml. Evite pegar qualquer proteína desnaturada presente na interface.

7. Repita a extração com clorofórmio:álcool isoamílico mais uma ou duas vezes (etapas de 4 a 6), levando em consideração que mais extrações podem tornar a amostra mais pura, porém com maiores perdas de DNA.

8. Adicione RNAse A a uma concentração final de 100 mg/ml e incube a 37oC por 30 minutos. Essa etapa é opcional e contribui para aumentar a pureza da sua amostra.

9. Adicione 0,6 volume de isopropanol ou 2,5 volumes de etanol absoluto, ambos a -20oC. Misture suavemente até formar um precipitado.

10. Se o complexo DNA-CTAB obtido formar uma rede de filamentos visíveis, recupere o DNA com o auxílio de uma pipeta. Caso o DNA não forme uma rede visível, centrifugue a amostra a 10.000 g por 20 minutos. Em uma boa preparação, o DNA não deve estar escuro. Sempre que possível, evite a etapa da centrifugação para não co-precipitar o DNA e polissacarídeos.

11. Descarte o sobrenadante e lave o precipitado com 5 ml de etanol 70% (v/v). Caso o precipitado se solte durante a lavagem, repita a etapa da centrifugação por 3 minutos(etapa 10).

12. Descarte o sobrenadante e seque o precipitado invertendo o tubo em um papel-toalha.

13. Dissolva o precipitado em 500 ml de tampão TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM) e incube a 4oC por meia hora ou mais. A amostra pode ser então armazenada a -20oC.

14. Uma purificação posterior pode ser realizada por tratamento com acetato de amônio ou por gradiente de cloreto de césio .

Purificação de DNA total de plantas por tratamento com acetato de amônio

1. Dissolva o DNA isolado em 1,0 ml de tampão TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM) e adicione 500 ml de acetato de amônio a