Imunoparâmetros Carcinicultura

IMUNOPARÂMETOS

COLETA DA HEMOLINFA E PREPARAÇAO DO SORO

1. Coleta de hemolinfa

Após higienizar bem com álcool 70% a região ventral do camarão, colete a hemolinfa da região ventral entre o último par de pereópodos e o primeiro par de pleópodos, através de uma seringa de 1 ml, acoplada a uma agulha de insulina. A hemolinfa assim extraída poderá ser utilizada de forma individual ou sob forma de pools de vários animais (de acordo com o interesse), e empregada no preparo das diferentes frações hemolinfáticas: SORO, PLASMA E HEMÓCITOS.

2. Preparo de soro

Para obtenção de soro, a hemolinfa é diretamente retirada do animal dentro da seringa e colocada em um tubo de 15 ml (ou menor) e deixada coagular por 1-2h a temperatura ambiente ou 24h a 4°C. O coágulo formado deve ser quebrado com o auxílio de um bastão de vidro e repetidamente centrifugado a 6.000 g por 10 min. O precipitado (coágulo) é desprezado e o sobrenadante, correspondente ao soro (contendo fatores plasmáticos e celulares) será removido e utilizado imediatamente nos ensaios, ou aliquotado (100 ou 200 µl) e congelado a –20°C para uso posterior.

HEMOGRAMAS

1. Contagem total de hemócitos (CTH)

1. Preparar previamente as seringas (1 ml) com MAS resfriado (o volume de Ac deve ser em função da quantidade de animais a serem coletados) e coletar aproximadamente de 10 a 100 µl de hemolinfa de cada animal. O importante é respeitar à proporção que deve ser 1:2, ou seja, 1 Hem: 2 Ac.

• É importantíssimo anotar o volume final coletado e a PROPORÇÃO, de cada amostra, para se fazer os cálculos corretos posteriormente.
  

1. Adicionar então 50 µl dessa hemolinfa (3x diluída) em 450 µl de fixador de hemócitos (MAS- formol 4%). Assim a hemolinfa (3x) será diluída mais 5x (1:4) no Mas formol e essas duas diluições devem ser consideradas no cálculo final.
2. Misturar a solução cuidadosamente com o auxilio de uma micropipeta;

Obs.: este material pode ser conservado por vários meses em geladeira para contagem posterior. Adicionar 10µl da mistura em uma câmara de Neubauer (hemocitômetro) deixando em repouso por 1 min;

1. Contar em um microscópio em objetiva de 40X.

[pic 1]

L: campos p/ contagem (quadrantes para leucócitos) → importante: antes de contar, observar se a distribuição das células está homogênea nos 4 quadrantes DE CADA LADO da CÂMARA, senão, refazer. Após, conta-se cada campo soma-se os resultados dos quatro campos ÷ 4 = Média X 5x (1:4 dil em MAS/formol) X 3x (dil inicial da hemolinfa; 1:2). Este valor é  multiplicado por 104 (= 10 é a altura da câmera + 103 é referente à conversão de mm3 para mL) =  Y X 106 ou 107 (dependendo da quantidade de células). O valor do THC será dado em 106 ou 107 céls/ mL.  

  Obs.: 1 mm3 = 0,001 mL

           1000 mm3= 1 ml → 103

CONTAGEM DIFERENCIAL DE HEMÓCITOS (CDH)

1. Colocar sobre uma lâmina uma pequena gota de hemolinfa fixada com formol (em anticoagulante), bem homogeneizada, e montar com lamínula com esmalte (nas laterais).
2. Contar um total de 100 células aleatoriamente na lâmina, em Microscópio de contraste de fase (Objetiva 100X), diferenciando-as em hialinas ou granulares.

Objetivas Microscópica de contraste de fase

[pic 2]

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PREPARO CURVA PADRÃO BSA – Método de Bradford

1. As amostras são diluídas primeiramente em eppendorfs novos e depois, para se realizar a leitura, a quantidade necessária é transferida para uma microplaca de fundo chato.
2. Utilizar estoques de uma solução proteica de Soro Albumina Bovina – BSA a 1 mg/mL –  congelada em alíquotas de 200 µL. O BSA diluído em água Milli Q.;
3. A partir de esta solução estoque preparar as amostras de BSA diluídas como abaixo especificado, em triplicata, em diferentes concentrações para obter a curva padrão, da seguinte maneira:

Branco - sem BSA  = 100 µl de água miliQ   (0 mg/100μL)

1. BSA 32 µg/100 µL = 320 µL de BSA (1 mg/mL) + 680 µL de água
2. BSA16 µg/100 µL = 500 µL da solução I (32 µg) + 500 µL de água
3. BSA 8 µg/100 µL = 500 µL da solução II (16 µg) + 500 µL de água
4. BSA 4 µg/100 µL = 500 µL da solução III (8 µg) + 500 µL de água
5. BSA 2 µg/100 µL = 500 µL da solução IV (4 µg) + 500 µL de água
6. BSA 1 µg/100 µL = 500 µL da solução V (2 µg) + 500 µL de água

1. Retirar 20 µL de cada solução acima (0 a VI= água ou BSA diluído), colocar na microplaca de fundo chato em  triplicata e adicionar 200 µL da solução de Bradford (preparada no máximo nos últimos 3 meses) (diluição de 10x).
2. Incubar a mistura por 15 minutos, a T ambiente;
3. Ler às absorbâncias em leitora de microplacas a λ= 595 nm;

IMPORTANTE: Todos os pontos acima, de 0 a VI, DEVEM ser plotados no gráfico para se fazer a Linha de tendência no Excel, cujo R2 deve ser o mais próximo possível de 1.

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CÁLCULO DA CURVA PADRÃO - BRADFORD

1. Fazer as médias das triplicatas das diferentes concentrações de BSA e do Branco;
2. Com esses resultados diminuir as médias de cada amostra do branco (para desconsiderar a cor do reagente Bradford);
3. Plotar os dados em um gráfico de linhas no Excel, onde no eixo X deve conter as concentrações e no eixo Y, as absorbâncias correspondentes.
   [pic 3]
4. Inserir a linha de tendência passando pela origem (ZERO)
5. OBS: Caso no obtenha um R2 inferior a 0,95, refazer a curva.

DILUIÇÃO DA HEMOLINFA TOTAL PARA CONCENTRAÇÃO PROTÉICA

• Hemolinfa coletada (1:2) (hem: Ac) 

1ª Diluição 30x	50 µl de hemolinfa (3x) +[pic 4] 450 µl de água destilada
2ª Diluição 300x	50 µl de hemolinfa (30x) +[pic 5] 450 µl de água destilada[pic 6]
3ª Diluição 900x	100 µl de hemolinfa (300x) + 200 µl de água destilada
4ª Diluição 3000x	50 µl de hemolinfa (300x) + 450 µl de água destilada