LABORATÓRIO DE FITOPATOLOGIA – EMBRAPA AMAZÔNIA ORIENTAL

1. IDENTIFICAÇÃO

Nome do estagiário: MYLLA LUZIA CORRÊA DE SOUZA

Local do estágio: LABORATÓRIO DE FITOPATOLOGIA – EMBRAPA AMAZÔNIA ORIENTAL

2.ATUAÇÃO

2.1.ATIVIDADES DESENVOLVIDAS

As atividades foram desenvolvidas no laboratório de Fitopatologia da Embrapa Amazônia Oriental, sob supervisão da Dra. Alessandra de Jesus Boari.

Inicialmente foram realizadas as apresentações sobre a dinâmica de trabalho do laboratório, o uso e funcionamento dos equipamentos, assim como a importância do uso de equipamento de proteção individual (EPI). Posteriormente iniciou-se as atividades propriamente ditas, descritas a seguir:

Lavagem da vidraria: Realizei a lavagem de erlenmeyer, becker e proveta na sala de recepção de amostras (sala de triagem) e organização das mesmas no armário conforme volume e forma.

Descarte de material: O descarte de placa de Petri e erlenmeyer contendo colônias de microrganismos foi realizado da seguinte forma: foi retirada à identificação feita com caneta usando álcool puro e algodão, e em seguida foram autoclavados a 121° C por aproximadamente 20 min. Posteriormente, fez-se a lavagem dos mesmos em água corrente e sabão. Alguns tipos de materiais precisaram ser enxaguados também em água destilada, como os almofariz e pistilo de porcelana usados para maceração de folhas destinados à extração de ácido nucléico total no laboratório. As lamínulas e lâminas usadas no microscópio foram colocadas em recipiente com água e sabão, lavadas e deixando por aproximadamente 12 horas em uma solução para desinfetar e depois enxaguadas.

Preparo de meios de cultura: Os microrganismos em sua maioria crescem em meios contendo uma fonte de nitrogênio e carbono, além de outros componentes em menor quantidade, sendo então classificados em sintéticos, semissintéticos e naturais. Durante o estágio pude preparar os meios considerados como sintéticos sólidos, que contém o ágar, responsável pela solidificação.

Foram preparados seis frascos do meio ágar-água, contendo cada um o volume de 150 ml. Primeiro pesou-se 3g de ágar, sendo adicionado posteriormente em cada erlenmeyer. Com a proveta colocou-se 150 ml de água destilada em cada erlenmeyer. Logo após vedou-se o frasco com algodão e jornal, e amarrando com barbante. Após esse procedimento, foram identificados com o nome do responsável pelo preparo, tipo de meio e data do procedimento, sendo em seguida os meios autoclavados.

Outro meio de cultura preparado foi o meio BDA (batata, dextrose, ágar). Foram preparados oito frascos de BDA no volume de 250 ml. Sendo que em cada frasco foram colocados 10 g de BDA e 250 ml de água destilada. Logo após, foram vedados com algodão, jornal e barbante. Após esse procedimento, foram identificados com o nome do responsável pela produção do meio, tipo de meio e data do procedimento, sendo em seguida os frascos autoclavados (Figura1).

Figura 1. Meios de cultura do tipo BDA (batata, dextrose, ágar).

Plaqueamento dos meios de cultura: Os meios de cultura após serem autoclavados foram guardados para solidificação.

Para o plaqueamento colocou-se o erlenmeyer com o meio de cultura no micro-ondas por cerca de 2 minutos, deixando-o esfriar até 40º C mais ou menos dentro câmara de fluxo. Com o meio já menos quente, adicionou-se antibiótico ampicilina. Logo após, distribui-se o meio nas placas bem próximo a chama (Figura 2), afim de evitar contaminações.

Figura 2. Distribuição de meio de cultura em placas de Petri na câmara de fluxo.

Isolamento de fungos: durante o período de estágio pude fazer o isolamento a partir de plantas de cebolinha inoculadas com Colletotrichum theobromicola e pimenta de cheiro inoculada com Colletotrichum truncatum. Para a realização desse isolamento, procedeu-se seguinte maneira: após a coleta e limpeza do material em água corrente e sabão, foram retirados fragmentos de tecido vegetal da área de transição entre o tecido sadio e o infectado, para submeter ao procedimento de desinfecção superficial em condições assépticas, e em seguida realizar o isolamento.

No processo de desinfecção os fragmentos foram imersos em álcool 70% por aproximadamente 30 segundos para quebra de tensão superficial do tecido, e tratados com hipoclorito a 20% por cerca de 1 minuto. Em seguida, os fragmentos foram imersos em água destilada para retirar o excesso de hipoclorito, e seco em papel filtro (Figura 3). Posteriormente, os fragmentos foram transferidos para placa de Petri contendo ágar-água, e as placas vedadas com filme plástico e identificadas.

Figura 3. Processo de desinfecção de material vegetal de cebolinha e pimenta de cheiro.

Inoculação de fungo: outra atividade desenvolvida ao longo do ESO foi a inoculação de fungos, ou seja, o teste de postulado de Koch. Na pesquisa, essa técnica é empregada para provar a patogenicidade de determinado organismo. Existem vários tipos de inoculo, como os esporos, escleróides e microescleróides, clamidósporo ou fragmento de micélio.

A inoculação feita na pimenta de cheiro com o patógeno do gênero Colletotrichum foi realizado através da deposição de disco de micélio e pulverização de suspensão conidial em plantas sadias.

O método por deposição de disco de micélio foi realizado da seguinte forma: com auxílio de uma agulha, foram feitas micro-lesões no limbo foliar, sem atravessar o mesmo, em seguida depositou-se o disco nas micro-lesões e vedou-se com filme plástico. Após a inoculação, o material permaneceu por tempo mínimo de 24 horas em câmara úmida.

O segundo método realizado foi por suspensão conidial, para isso utilizou-se novamente uma agulha para realizar as micro-lesões nas folhas. Em seguida, pulverizou-se os conídios do patógeno, com auxílio de um spray. Após a inoculação, as plantas permaneceram por tempo mínimo de 24 horas em câmara úmida.

Foi feito também uma planta de pimenta de cheiro aspergida apenas com água, mantendo assim, como as demais em câmara úmida, para servir como testemunha.

Repicagem de fungos: outra técnica aprendida em meu ESO foi como fazer a manutenção de fungos por meio da repicagem. Nesta técnica, em geral, deve-se transferir apenas