O RELATÓRIO PCR BIOLOGIA MOLECULAR

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA

CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DISCIPLINA DE BIOLOGIA MOLECULAR

LIZANDRA MARIA DE AGUIAR ZANON SOARES

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA

EXTRAÇÃO DE DNA

12/09/2018

1. INTRODUÇÃO

O DNA é um ácido nucleico presente em todas as células dos organismos vivos, além de ser responsável por carregar toda a informação genética (ALONSO et al, 2003). A extração de ácidos nucléicos é o passo de saída para a realização da maioria das técnicas biomoleculares, podendo o DNA ser obtido a partir de inúmeros tipos de tecidos e células (tecido animal, tecido vegetal e microrganismos).  A extração se baseia na lise das membranas lipídicas, purificação, preciptação e reidratação do DNA, para que assim possa ser aplicado à tecnica de leitura ou quantificação escolhida (WATSON et al, 2015).

A metodologia adotada para extração foi de acordo com a origem celular utilizada (bactéria Gluconacetobacter diazotrophicus) e a análise do DNA extraído foi feita através de eletroforese em gel, sendo o princípio dessa técnica baseado no fato da molécula de DNA possuir carga negativa em valores de pH neutro e consequentemente, quando aplicada na matriz de gel submetida a um campo elétrico, migra em direção ao pólo positivo. A movimentação e migração das moléculas carregadas em um campo e!étrico na eletroforese ocorre através de um gel que funciona como filtro, separando essas moléculas. A separação desses fragmentos depende da concentração da agarose, do tamanho do fragmento e da voltagem aplicada durante a eletroforese (OLIVEIRA, 2007).

1. OBJETIVOS

O objetivo da aula prática foi extrair, purificar e quantificar a amostra de DNA da bactéria Gluconacetobacter diazotrophicus através da técnica de eletroforese em gel.

1. MATERIAIS E MÉTODOS 

• Tipo celular utilizado: cultura bacteriana (Gluconacetobacter diazotrophicus).

• Meterias: pipetas, luvas, tubos eppendorf e reagentes específicos para extraçãod de DNA.

• Equipamentos: centrifuga, cuba de eletroforese, vortéx (agitador), espectofotômetro (NaNoDrop ND-1000 UV-Vis)

• Foi transferido 1,5mL de cultura bacteriana para o tubo tipo eppendorf e centrifugado a 14.000 RPM por 2 minutos.
• O sobrendante foi descartado e o precipitado ressuspendido com o meio que restar no tubo com o auxílio do vortéx.
• Acrescentou-se 300μL de Plant DNAzol (auxilía na alta qualidade de isolamento do DNA), que foi agitado por 5 minutos em temperatura ambiente.
• Acrescentou-se 300μL de clorofórmio (utilizado para purificação do DNA, provocando a desnaturação das proteínas de maneira eficiente), que foi agitado por 5 minutos em temperatura ambiente.
• O material foi centrifugado durante 10 minutos a 10000 rpm e a fase aquosa foi transferida para outro tubo.
• O DNA foi precipitado pela adição de 2,5 volumes (aproximadamente 300 μL) de etanol 100%, misturado por inversão e incubado durante 5 minutos em temperatura ambiente.
• Novamente o material foi centrifugado durante 4 minutos a 12000 rpm e descartado o sobrenadante.
• O precipitado foi lavado com 300 μL de etanol 70% gelado e centrifugado durante 4 minutos a 10000 rpm.
• O sobrenadante surgido foi descartado, o precipitado foi secado e ressuspendindo em 50 μL de TE RNAse.
• A amostra foi incubada a 37°C por 1 hora e armazenada em freezer -20°C para posterior aplicação das amostras nos poços eletroforéticos.
• Foi utilizado o espectofotômetro para fazer a quantificação do DNA.

1. RESULTADOS E DISCUSSÕES

A interpretação do gel ocorre de acordo com a intensidade das concentrações apresentadas nas bandas. Abaixo, apresentado na figura 1, a banda C3 não demonstrou migrar no gel (quando a banda migra/se espalha é sinal de degradação do DNA), tratando-se assim de uma banda de boa qualidade. O gel de agarose vai permitir que se verifique o sucesso da extração de DNA, pois quanto mais forte e corada a banda, maior a quantidade de DNA extraído; no caso do resultado da amostra C3, observa-se uma banda nítida, porém abaixo da quantificação esperada.

No que se refere a razão de absorvâncias, pode-se inferir que a razão ficou em 85,43 ng/uL, não demonstrando um total grau de pureza do DNA, o que também influência em como a banda de destaca no gel.

[pic 1]

Figura 1 – Gel de eletroforese das amostras de DNA

1. CONCLUSÕES

Dado a análise dos resultados da amostra C3, a extração, purificação e quantificação do DNA foi alcançada sem que ocorresse degradação do mesmo; porém, apesar da extração eficaz e sem fragamentação, a amostra não atingiu seu grau total de pureza, formando uma banda menos nítida e abaixo da qualidade esperada.  

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