Relatório de Enzimologia Industrial

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO (UFPE)

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS (DCFAR)

DEPARTAMENTO DE ANTIBIÓTICOS

Relatório de Enzimologia Industrial:

Efeito da Temperatura na Atividade da Invertase

GRUPO:

Josefa Graziele Silva Fonseca

Jackson Roberto da Silva

Maria Larissa Galdêncio de Oliveira

Pâmala Germano do Nascimento

Rayane Ellen Santos da Silva

Recife, 2023

Objetivo da prática

Avaliar o efeito da temperatura na reação enzimática da invertase, na obtenção de açúcar invertido a partir da sacarose.

Materiais

• Água destilada
• Solução tamponada de sacarose 0,3 M (tampão acetato pH 5,5);
• Solução contendo enzima Invertase;
• DNS (reativo ácido 3,5-dinitrossalicílico);
• 7 Tubos de ensaio;
• Estante para tubos de ensaio;
• Micropipeta Monocanal;
• Panela multiuso para banho-maria;
• Cronômetro digital;
• Banho-maria digital
• Dispensador de líquidos;
• 4 pipetas graduadas;
• Pêra;
• Pote com água gelada
• Garrafa com água congelada

Métodos

O procedimento para a avaliação do efeito da temperatura na atividade da invertase, consistiu em preparar, inicialmente, 03 tubos com soluções idênticas contendo 1 mL de solução tamponada de sacarose 0,3 M e 1,0 mL da solução amostra contendo invertase (Imagem 1). Logo após, submetê-los, individualmente, a banhos em temperaturas distintas (12ºC, 36ºC e 60ºC) por 05 minutos, em um banho maria digital. Para tanto, inicialmente, foi estabelecida a temperatura de 12ºC no banho maria digital, para que durante a acomodação do equipamento à temperatura desejada, a equipe realizasse a identificação dos tubos e preparação das soluções.

Os tubos de ensaio, limpos e secos, foram devidamente rotulados da seguinte forma: Branco 01, T1, T2, T3, T4, T5 e T6,  para identificar cada amostra. No tubo Branco 01, utilizado como controle inicial para a etapa analítica da presença de açúcares redutores, foi adicionado 1,0 ml Solução Tamponada de Sacarose 0,3 M, 1,0 ml de água e 0,5 mL do reativo DNS, sem a adição da enzima invertase.  Nos tubos T1, T2 e T3 foram adicionados 1,0 mL da solução tamponada de Sacarose a 0,3M e 1,0 mL da solução amostra contendo invertase. A adição da solução contendo a enzima só foi realizada quando o equipamento alcançou a temperatura experimental, a fim de evitar degradação enzimática devido à exposição à temperatura ambiente. A mistura foi homogeneizada para garantir uma distribuição uniforme dos componentes.

Os tubos T1, T2 e T3 foram colocados, individualmente e em momentos distintos, em banho-maria, respectivamente, a 12ºC, 36ºC e 60ºC, por 05 minutos. Imediatamente após a incubação, foram transferidas alíquotas de 1,0 mL de cada amostra para outros tubos, sendo: amostra do tubo T1 para o tubo T4; do tubo T2 para o tubo T5 e do tubo T3 para o tubo T6. Aos tubos T4, T5 e T6 foi acrescentado 0,5 mL do reativo DNS. Esses tubos foram, então, levados ao banho-maria por 05 minutos a 100ºC, bem como o tubo contendo a solução controle, para constatação da atividade enzimática por meio da reação do DNS com os açúcares redutores (Imagem 2).

Após realização da etapa de verificação da atividade enzimática, banho-maria a 100ºC por 05 minutos, observou-se que houve reação no tubo controle (Imagem 3). Para contornar tal situação, foi confeccionado um novo controle, contendo apenas 1,0 mL de água destilada e 0,5 mL do reativo DNS. O procedimento do banho-maria a 100ºC foi repetido e o tubo de controle não demonstrou reação, como esperado.

Branco 01:  água + DNS + sacarose (reação indevida) / 01: água + DNS / T1: sacarose + enzima  /T2: sacarose + enzima /T3: sacarose + enzima / T4: 0,5 de DNS + (sacarose e enzima) + água / T5:  0,5 de DNS + (sacarose e enzima) + água / T6: 0,5 de DNS + (sacarose e enzima) + água

 

Resultados e discussão

Após concluídas todas as etapas, não foram observadas diferenças significativas de coloração entre as amostras. O que contraria a expectativa de acordo com a literatura.

O efeito da temperatura na atividade enzimática pode ser descrito em um gráfico semelhante a uma parábola, onde se visualiza uma uma zona ótima, a partir da qual, à medida que se eleva a temperatura, ocorre a desnaturação da proteína da enzima (WHITAKER, 2003) e perda do sítio ativo  (DANIEL et al., 2010). Para a invertase, o efeito da temperatura pode variar de acordo com a origem da enzima. Andjelković et al. (2010) observaram uma ótima temperatura de 60ºC para invertase de S. cerevisiae. Para invertase de Aspergillus casiellus, Novak (2009) observou valor superior a 70ºC. Em estudo de extração e caracterização de invertase obtida através de purê e resíduo de pêssego, Toralles et al. (2014) descreveram as temperaturas ótimas na faixa de 40 – 50 °C para invertase de levedura de pão e na faixa de 20 – 30 °C para invertase de levedura de purê de pêssego.