Resumo de Biologia Molecular

PCR: Princípios e Tipos

Histórico

- Em torno de 1943 se teve ínicio da utilização de iniciadores específicos (Primers) e

DNA pol para técnica de PCR

- Em 1986 iniciou se a utilização da DNA polimerase termoestável

Reação em cadeia da Polimerase(PCR)

Aplicada a Biologia Molecular, Genética, Biotecnologia, Medicina, Microbiologia, Ciencias

Forenses e em outras diversas áreas.

PCR: Príncipios Básicos

Técnica de amplificação enzimática in vitro que permite copiar seletivamente sequências de

DNA ( ou RNA, com retrotranscrição prévia), levando a um aumento exponencial da

quantidade inicial de fitas moldes.

Para que uma PCR seja realizada é necessário:

- DNA Molde

- Iniciadores de oligonucleotídeos (primers)

- Desoxinucleotídeos trifosfatados (dNTPs)

- Dna polimerase (Taq, Pfx)

- Tampão

- MgCl2, MgSO4

- Termociclador

Ciclos de amplificação

(...)

Reação de PCR: Otimização

OS parâmetros de otimização de uma PCR são:

- O anelamento dos primers

- A concentração de ions de magnésio (MgSO4)

- Concentração de nucleotídeos

- Concentração de enzimas

- Concentração de primers

- Estratégias de ciclagem

- Adjuvantes: DMSO(1-10%), BSA(10-100 ug/ml), glicerol(5-20%) ajudam na

desnaturação do DNA.

- Oligonucleotídeos Iniciadores (primers)

- Desenho adequado(ex: homologia no extremo 3')

- Conteúdo de Guanina e Citosina( ideal de 50%)

- Tamanho (ideal de 15 a 30 nucleotídeos)

- Evitar a formação de estruturas secundárias

- Evitar complementaridade

- ™ próximos

*Formúla para equilíbrio da quantidade de nucleotídeos (A+T)2 + (G+C)

* Fórmula para calcular temperatura de primers(2C para A+T e 4C para G+C e depois

soma)

Concentração de Íons de magnésio (MgCl2)

- Co- fator essencial de polimerase

- concentração ótima de 1,5 - 5mM

- Concentrações muito baixas irão diminuir a eficiência de hibridização dos primers e

a atividade da polimerase

- concentrações muito altas irão provocar a amplificação de fragmentos inespecíficos

Concentração de dNTPs

- Devem estar na mesma concentração

- concentração ótima de 200uM

- concentrações altas reduzem a concentração de Mg++ e ´podem inibir a atividade

da Taq polimerase

- Concentrações baixas diminuem a eficiência de amplificação.

DNA polimerase

- Taq DNA polimerase tipo I (Eubacteria) (3’ AAA)

- Pfu DNA poliemrase B (Archaea)

- Atividade exonucleásica 5’-3’;3’-5’ (proofreading)

- Hot Start aumenta a especificidade

- Concentração 1 a2 U/ reação

- Concentrações altas diminuem a especificidade

- Concentrações baixas diminuem a eficiência da reação.

Estratégias de Ciclagem

- Hot Start PCR ( desnaturação a 95C de 3-15 min)

Condições que aumentam especificidade

- Hot start

- Variações rápidas de temperatura

- Baixa concentração de Mg++

- Baixa concentração de dNTPs

- Baixa concentração de Taq } sem afetar a eficiência de amplificação

- Baixo número de ciclos

*A detecção dos produtos amplificados se dá a partir da eletroforese em gel de

agarose

A garantia de qualidade vem dos laboratórios de PCR

Dia “limpos”

1- Preparo de amostras

(Extração de DNA ou RNA)

2- Área Pré-PCR

(Preparo das reações de PCR)

Dia”sujos”

3- Área Pós-PCR

(Análise de resultados e interpretação de dados)

Variações de técnica de PCR

- RT-PCR (reverse transcriptase PCR)

É a utilização de um passo de transcrição reversa de moléculas de RNA antes da

amplificação por PCR. Mais comumente empregado para detecção de vírus cujo material

genético é baseado em RNA (Ex; HIV) e em análises de expressão gênica.

- PCR-Multiplex

É detecção simultânea de várias sequências-alvo através da incorporação