Visão geral e descrição das técnicas de biologia molecular utilizadas na medicina forense

1 Autora: Bióloga. Estudante do Programa de Pós-Graduação em Biociências Forense, pelo Instituto de Estudos

Farmacêuticos e Pontifícia Universidade Católica de Goiás. E-mail: [e-mail]

2 Orientador: Docente do Programa de Pós-Graduação em Biociências Forense, pela Pontifícia Universidade

Católica de Goiás e Instituto de Estudos Farmacêuticos, SHCGN 716 Bl. B Lj 05 Brasília-DF CEP: 70770-732.

E-mail: [e-mail]

RESUMO

Nos últimos 20 anos a molécula de DNA tornou-se um elemento poderoso na identificação humana e

investigação criminal. Há várias técnicas de Biologia Molecular que são usados na investigação forense pela

análise de DNA, RNA ou proteínas. O objetivo básico do presente trabalho foi descrever as principais técnicas

moleculares utilizadas no Brasil para fins forenses. Para isso, recorreu-se a uma revisão de literatura atualizada

das várias técnicas moleculares validadas e aceitas pela justiça como prova. Observou-se que as técnicas estão

sendo aprimoradas continuamente e que no meio da investigação forense o uso de DNA está em grande

ascendência tanto para fins de investigação como pela justiça. Isso demonstra a importância e justifica os

trabalhos que contribuem para aprimorar o desenvolvimento e difusão das técnicas moleculares para fins

forenses, disponibilizando as melhores e mais atualizadas ferramentas de trabalho, para que estes possam

oferecer resultados da investigação precisos e seguros, e com isso, aprimora a investigação forense e o judiciário

brasileiro.

Palavras-chave: Genética forense, marcadores de DNA, perfil de DNA, polimorfismo humano.

Molecular biology techniques applied to Forensic Investigation

ABSTRACT

Over the past 20 years the DNA molecule has become a powerful element in human identification and criminal

investigation. There are several techniques of molecular biology that are used in the analysis of forensic DNA,

RNA or protein. The basic objective of this study was to describe the molecular techniques used for forensic

purposes in Brazil. For this, we used a review of current literature of molecular techniques validated and

accepted by the courts as evidence. It was noted that the techniques are being continually improved and that in

the middle of the forensic use of DNA parentage is in great both for research purposes and for justice. This

demonstrates the importance and justifies the work that contribute to improve the development and

dissemination of molecular techniques for forensic purposes, providing the best and most current tools, to enable

them to offer research results accurate and reliable, and thus, improves forensic investigation and the Brazilian

judiciary.Keywords: Forensic Genetic, DNA markers, DNA profile, human polymorphisms.

1. INTRODUÇÃO

A biologia molecular tem como foco o estudo da estrutura e da função do material

genético e de seus produtos de expressão que são as proteínas. Ou seja, a função da biologia

molecular é investigar as interações entre os diversos sistemas celulares, incluindo a relação

entre ácido desoxirribonucléico (DNA), ácido ribonucléico (RNA) e síntese protéica. Seu

campo de estudo abrange várias áreas da biologia e da química, podendo considerar-se a

biologia molecular uma ligação entre a bioquímica e a genética.

A partir de meados dos anos 80, os avanços nas técnicas de DNA propiciaram

significativo impacto no campo da ciência forense, e foi pelas técnicas de identificação, e

análise do DNA, que se verificou que esta era uma poderosa ferramenta para a identificação

humana e para a investigação criminal (KOCH & ANDRADE, 2008).

Em geral, na cena de crime encontram-se diversos tipos de vestígios biológicos, que

por meio dos testes de DNA podem tornar-se evidências importantes, sendo inclusive possível

a identificação de suspeitos, excluindo também inocentes, cabendo ao perito identificar o tipo

de amostra encontrada e qual melhor técnica de identificação, sem esquecer que os exames

devem ser realizados com a utilização de métodos científicos e os laudos devem ser escritos

em linguagem ética e juridicamente perfeita (DOREA et al. 2005).

Segundo o legista Francisco Corte-Real do Instituto de Medicina Legal (INML-MS),

esta área do saber é extremamente importante para ajudar a deslindar casos que, de outro

modo, jamais seriam resolvidos (FELGUEIRAS, 2008).

A caracterização e manipulação dos componentes moleculares das células e

organismos somente foi possível, primeiro pela descoberta do núcleo celular e da sua

composição química. E, segundo foi o conhecimento e a identificação do DNA como material

genético e suas propriedades químicas e físicas que permitiu avanços para identificação

forense (DUCLOS, 2004).

O reconhecimento de que era possível definir marcadores moleculares que são únicos

em cada indivíduo, e com isso a identificação individual, torna esse processo muito

interessante para fins forenses. Essa técnica de identificação denomina-se de DNA fingerprintou de perfil de DNA e baseia-se no fato de que as pessoas são únicas e possuem marcadores

no genoma que as diferencia dos demais e os únicos que são idênticos são os gêmeos

univitelinos (RUI, 2003/2004, KOCH & ANDRADE, 2008).

Neste contexto, o presente trabalho apresenta um levantamento e descrição das

principais técnicas de biologia molecular utilizadas na investigação forense, considerando os

benefícios e as limitações destas técnicas, assim como, entender a legislação que rege o uso

das técnicas moleculares na investigação forense.

2. METODOLOGIA

O presente trabalho é uma pesquisa qualitativa, de modalidade teórica e com análise

da bibliografia formal, discursiva e concludente. O método de abordagem indutivo foi

escolhido como procedimento monográfico, realizando o levantamento das publicações em

base de dados nacionais, com o objetivo de identificar as principais técnicas moleculares

utilizadas na investigação forense.

Com este propósito foi efetuada uma revisão do acervo de documentos

bibliográficos, baseados em artigos científicos e regulamentos disponíveis nas bases de dados

disponíveis em bibliotecas virtuais e sítios da rede mundial de computadores. A busca foi

realizada no idioma português através de palavras chaves relacionadas com o trabalho em

questão como, uso de técnicas moleculares forenses. Sendo que, foram encontrados artigos

em diferentes idiomas.

Para revisão, considerou-se documentos publicados de 2001 a 2011. Este recorte

temporal foi escolhido em função da maior disponibilidade de bibliografia e o crescente

avanço que a investigação forense tem alcançado. O assunto abordado apresenta um número

significativo de estudos, o que possibilitou elencar a eficiência e a limitação das diferentes

técnicas hoje utilizadas, descrevendo também o que prevê a legislação.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na área forense, as técnicas de biologia molecular vêm-se fortalecendo no transcorrer

dos últimos vinte e cinco anos (Figura 1). Isso em função do desenvolvimento de técnicas

cada vez mais sofisticadas e em número cada vez maior. Esta evolução somente foi possívelpelo desenvolvimento e compreensão da biologia molecular e a descoberta de novas técnicas

e métodos eficazes para a detecção do DNA humano para fins forenses. Um levantamento

realizado no banco de dados PUBMED, usando os termos de pesquisa “técnicas de DNA para

genética forense em humanos” (DNA techniques for human forensic genetic), realizado em

março de 2011, mostrou que em 1985, somente dois artigos mencionavam o uso de técnicas

de DNA em forense humana, enquanto que vinte e cinco anos depois, (em 2010) eram

duzentos e oitenta e cinco artigos. Observa-se também que a cada cinco anos, praticamente o

número de publicações dobra em relação ao ano anterior. Esses resultados apontam para um

consistente avanço e desenvolvimento de novas técnicas de investigação forense em humanos

(Figura 1).

1985 1990 1995 2000 2005 2010

0

50

100

150

200

250

300

Número de Publicações

Anos considerados

Figura 1. Resultado do levantamento do número de publicações no banco de dados do PUBMED, relacionados

às técnicas de DNA para genética forense em humanos (DNA techniques for human forensic genetic), realizado

em março de 2011.

Com o aprimoramento das técnicas é cada vez mais eficiente a recuperação de traços

do material biológico em cenas de desastres ou crimes. Esses traços contêm evidências de

DNA que ajudam a identificar vítimas, suspeitos e exonerar inocentes. Pela importância que a

investigação forense vem adquirindo nos últimos anos, as técnicas e os métodos de

identificação de amostras têm se desenvolvido na mesma proporção. A frequência de sua

utilização, exige cada vez mais estudos de desenvolvimento e aprimoramentos das técnicas

que utilizam DNA para fins forenses (AZEVEDO, 2009).3.1. Procedimentos de coleta do material biológico para fins forenses

Amostras físicas e biológicas que não são coletadas, documentadas e preservadas de

modo apropriado não permitem obter bons resultados ou não possuem valor científico em

investigações criminais (PARADELA et al., 2001).

Para fins forenses o material biológico (em especial o DNA) deve ser coletado, acondicionado

e manipulado com critérios rígidos e restritos para que em análises posteriores produza os

resultados desejados e fidedignos. O método de coleta dependerá do estado e condição das

amostras, devendo-se coletar uma quantidade significativa. Considera-se também que as

amostras de DNA podem sofre alterações que afetam a cadeia de nucleotídeos, modificando

assim sua composição e estrutura, o que impossibilita o uso da amostra. Para que isso não

ocorra esta deve ser mantida em ambiente o mais frio e seco possível, evitando que sua

atividade biológica não seja perdida (SILVA & PASSOS, 2006).

Dado a grande importância de coletar as amostras biológicas em condições adequadas

para fins forenses são necessários materiais que além de caros, são também importados, o que

pode em determinadas circunstâncias resultar em morosidade e dificuldade de acesso, daí a

importância de preservar o material e usá-lo adequadamente ao fim propostos. Assim, o

próprio perito ou a sua instituição podem produzir um ”kit” de materiais para coleta, que são

facilmente encontrados. O kit de coleta e preservação deve ser usado somente para essa

finalidade, evitando assim contaminação do material.(SILVA & PASSOS, 2006).

Entre os principais materiais que compõem o kit e que atendem as necessidades em

quase todos os casos, tem-se:

1. Maleta – destinada para transporte e armazenamento do material de coleta;

2. Suabe e/ou Cotonete (algodão ou dracon) – utilizado na coleta de material líquido

ou em manchas secas. Pode ser utilizado cotonete comercial;

3. Água destilada estéril – utilizada para umedecer o suabe (ou cotonete);

4. Pinças – coleta de cabelo ou material sólido;

5. Luvas descartáveis (de procedimento);

6. Máscara cirúrgica;

7. Touca cirúrgica;

8. Envelopes – transporte e armazenamento das amostras;

9. Seringas descartáveis – coleta de líquidos;

10. Coletor universal – acondicionamento e transporte de amostras;

11. Tubos plásticos – acondicionamento de transporte de amostras;

12. Espátula descartável – para coleta de amostras sólidas;

13. Estilete (com lâminas descartáveis) – efetuar cortes em tecidos, couro, etc.;

14. Bisturi (com lâminas descartáveis) – efetuar pequenos cortes e raspagem de

amostras secas;15. Tesoura – efetuar cortes em geral;

16. Palito de cutícula – para coleta de amostras sob as unhas;

17. Algodão hidrófilo;

18. Fita adesiva – coleta de amostras;

19. Papel (tipo ofício/A4) – coleta e acondicionamento de amostras;

20. Isopor (pedaços) – fixar suabe ou cotonetes para secar e transportar;

21. Sacos plásticos – transporte e armazenamento de amostras;

22. Sacos de papel - transporte e armazenamento de amostras;

23. Caixa para transporte de suabe;

24. Caixa de isopor pequena – transporte das amostras (SILVA & PASSOS, 2006).

Para cada tipo de material biológico com potencial uso forense, exige-se um tipo

diferente de coleta. Quando se trata de fluídos (sangue, esperma, saliva e outros), e este estive

em estado líquido e em pequenas quantidades, deverá ser coletado através de suabe estéril. Se

for em quantidade maior usa-se uma seringa descartável estéril. Se o fluído estiver seco e em

pequenos objetos ou roupas, os mesmos deverão ser encaminhados para análise, se estiver em

grandes objetos ou em superfícies de metal, paredes ou móveis, deverão ser retirados

utilizando-se bisturi ou espátula, ou ainda suabe umedecido com água estéril. Objetos que

possam ser cortados utilizam-se tesoura e quando o fluído estiver em partes do corpo humano

utilizam-se pinças para sua retirada (PARADELA et al., 2001).

No caso do sangue líquido coletado recomenda-se que este seja preservado com

anticoagulantes. Entretanto, deve-se atentar ao fato de que algumas das substâncias

empregadas podem afetar a Reação em Cadeia da Polimerase (do inglês, Polymerase Chain

Reaction – PCR), que é uma etapa primordial em se tratando de análise de DNA. O EDTA

(do inglês, Ethylenediaminetetraacetic acid) pode ser usado, desde que em concentrações

indicadas para este fim (AZEVEDO, 2009).

No caso das amostras serem compostas de tecidos (osso, pele, sangue, unhas, etc),

órgãos, pêlos com bulbo capilar (raiz), estes devem ser documentados pela descrição ou

fotografia. O material de coleta deve ser estéril e cada item deve ser acondicionado

separadamente, selado e identificado (SILVA & PASSOS, 2006).

Para amostras de saliva, urina e outros fluidos corporais líquidos, estes devem ser

envasados em recipientes neutros e estéreis. Deve-se manter este material acondicionado a

frio e na ausência de luz (SILVA & PASSOS, 2006).

Caso se trate de manchas de fluidos corporais (sangue, sêmen, saliva, etc), faze-se a

documentação e em seguida coleta-se parte do material biológico no qual este esteja aderido

(por exemplo, lençol, vestes, etc.), ou quando se trata de objetos maiores ou metálicos coleta-se com utensílios apropriados, acondicionado as amostras em recipientes neutros e estéreis,

tendo o cuidado de evitar contaminações (SILVA & PASSOS, 2006).

Todo procedimento de coleta de material biológico para análise deve considerar

preceitos de biossegurança padronizadas pela legislação e pelos programas de acreditação

laboratorial, visando a proteção pessoal do perito e evitando o que se denomina de erro

humano. Após a coleta e acondicionamento apropriado dos materiais, estes devem ser

encaminhados à laboratório credenciado e preparado para análise (SILVA & GONTIJO,

2010).

3.2. Principais marcadores moleculares utilizados para obtenção de perfis genéticos

Fluidos biológicos como normalmente contêm células, podem ser usados como fonte

de DNA. As amostras mais comuns são: sangue, suor, pêlos, saliva, urina, sêmen, ossos,

unhas, pele, fezes, entre outros (DOLINSKY & PEREIRA, 2006).

Os principais marcadores moleculares podem ser agrupados em dois tipos: a) os de

polimorfismos de comprimento e b) os de polimorfismos de seqüência (MUNIZ & SILVA,

2010).

Os polimorfismos de comprimento incluem regiões que se repetem no DNA genômico

e são chamados de microssatélites (STRs) e minissatélites (VNTRs) sendo os mais estes os

mais usados na atualidade. A investigação ser realizada através de sondas de DNA ou pela

técnica de PCR. Estes polimorfismos entre indivíduos fundamenta-se pela diversidade e a

variação do número de repetições entre os indivíduos (DOLINSKY & PEREIRA, 2006).

Já os polimorfismos de seqüência constituem-se de diferentes nucleotídeos em uma

determinada localização no genoma, sendo que suas variações podem ser manifestadas como

regiões de alelos alternativos, substituições, adições ou deleções de bases (MUNIZ & SILVA,

2010).

A grande diversidade nestas regiões se dá pelo número de repetições de uma dada

seqüência de bases que varia entre indivíduos, podendo ser de 1 a 4 bases nos STRs e de 10 a

100 bases nos VNTRs. Cada possibilidade de tamanho (ou de número de repetições)

representa um alelo (DOLINSKY & PEREIRA, 2006).

Os VNTRs (do inglês, Variable Number of Tandem Repeats) são seqü