¬Heterodimeric L-amino acid oxidase enzymes from Egyptian Cerastes cerastes venom: Purification, biochemical characterization and partial amino acid sequencing
Por: daphnecukierman • 18/10/2015 • Artigo • 1.012 Palavras (5 Páginas) • 818 Visualizações
Abstract:
- Isoformas Cc-LAAOI e Cc-LAAOII
- Purificadas em protocolo cromatográfico de duas etapas sequenciais: filtração com gel e cromatografia de troca aniônica.
- Peso molecular das isoformas é de 115 kDa, determinado pela filtração com gel. - Peso molecular monomérico das enzimas é 60, 56 kDa e 60, 53 kDa para LAAOI e LAAOII respectivamente.
- Valores ótimos de pH e temperatura para Cc-LAAOI e Cc-LAAOII são 7,8, 50 oC e 7, 60 oC, respectivamente.
- Ambas são termoestáveis até 70 oC.
- Valores de Km e Vmax são 0,67 mM, 0,135 umol/min para LAAOI e 0,82 mM, 0,087 umol/min para LAAOII.
- Ambas apresentam alta preferência catalítica por amino ácidos de cadeia longa, hidrofóbicos e aromáticos.
- Íon Mn2+ aumenta significativamente a atividade das duas isoformas, enquanto que Na+, K+, Ca2+, Mg2+ e Ba2+ aumentam não significativamente.
- Íons Zn2+, Ni2+, Co2+, Cu2+ e Al3+ inibem significativamente as atividades das LAAOI e LAAOII.
- L-Cisteína e GSH inibem completamente a atividade de ambas isoenzimas, enquanto que B-mercaptoetanol, O-fenantrolina e PMSF inibem completamente a atividade da LAAOII.
- Ácido iodoacético inibe a atividade enzimática de LAAOII em 46% e não tem efeito na atividade da LAAOI.¬
Introduction:
- L-aminoácido oxidases representam 1-9% das proteínas totais em venenos.
- snake venom LAAOs = flavoenzimas que servem para catalisar a desaminação oxidativa estereoespecífica de um L-aminoácido para dar origem a um alfa-cetoácido, amônia e peróxido de hidrogênio.
- A maioria dos sv-LAAOs são homodímeros com subunidades de pesos moleculares de cerca de 50 a 70 kDa e as formas nativas tem cerca de 120 kDa.
- As subunidades interagem através de interações não covalentes.
- sv-LAAO pode ser encontrada nas formas ácida, neutra e básica da proteína.
- Cristalografia de raios-X: sv-LAAO é um dímero funcional com cada dímero possuindo três domínios.
- Atividades biológicas = efeitos de agregação citotóxica, apoptótica e de plaquetas, atividades antiparasítica e bactericida – devido à atividade da L-amino oxidase das proteínas resultando na produção de peróxido de hidrogênio com radicais livres de oxigênio causando estresse oxidativo.
Material e métodos
# Purificação da enzima LAAO do veneno
- Coleta do veneno de cobras adultas no habitat natural.
- Veneno foi liofilizado e guardado a -20 oC (as amostras foram descongeladas e centrifugadas antes do uso)
- 100 mg de veneno dissolvido em 1 mL de tampão Tris-HCl 50 mM pH 8 – carregado na coluna (tampão usado para equilíbrio da coluna e eluição das amostras carregadas).
- Frações de 4 mL foram coletadas em vazão de 24 mL/h.
- As frações ativas contendo atividade de LAAO foram juntadas em um pool e aplicadas diretamente na coluna de separação equilibrada com o mesmo tampão.
- As proteínas não ligadas foram lavadas com o tampão de equilíbrio, enquanto que as proteínas ligadas foram eluídas usando 0-0,3 M NaCl com vazão de 36 mL/h.
- Frações de 3 mL foram coletadas e a atividade de LAAO foi determinada pelo método de Kishimoto e Takahashi.
- As frações apresentando atividade de LAAO foram juntadas em um pool, guardadas a 4 oC e designadas como Cc-LAAOI e Cc-LAAOII.
- Absorvância medida em 260 nm.
- Processos cromatográficos foram realizados em temperatura ambiente e as frações de enzima foram guardadas a 4 oC.
# Eletroforese com gel de poliacrilamida (PAGE)
- Sob condições não desnaturantes, com gel 10% acrilamida, método de Davis, usando Tris glicina, tampão pH 8,3. As bandas das proteínas foram localizadas utilizando coração com Coomassie blue.
# Determinação do peso molecular
- Filtração por gel
# Atividade da L-Aminoácido oxidase (LAAO)
- Foi realizado em microplaca, em duplicata. 10 uL da solução de enzima foi incubado com 90 uL de mistura de reação contendo 5 mM L-leucina como substrato, 0,81 U/mL HRP e 2 mM OPD em tampão Tris_HCL 50 mM pH 8,0 a 37 ºC. Após 1h, a reação foi finalizada com a adição de 20 uL de H2SO4 2 M.
- A quantidade de produto (H2O2) foi estimada medindo a absorbância
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