INTRODUÇÃO À BIOLOGIA MOLECULAR

INTRODUÇÃO À BIOLOGIA MOLECULAR

A Biologia Molecular é o campo da biologia que estuda a composição, estrutura e interação de moléculas celulares, como ácidos nucleicos e proteínas, que carregam as informações e os processos essenciais para o funcionamento e manutenção celular. Além disso, trabalha também com as técnicas de manipulação de tais moléculas celulares. Definições importantes:

INSERTO: DNA alvo (de interesse) a ser carreado por um vetor. Formas de obtenção: digestão de material genômico, amplificação por PCR, transcrição reversa.

CLONAGEM: processo de obtenção dos clones, que vai desde a identificação do DNA alvo, seu isolamento, inserção no vetor e posteriormente do vetor na célula hospedeira e isolamento dos clones.

CLONE: colônias individuais advindas de uma única célula com o mesmo DNA recombinante (cópias idênticas).

VETOR: material genético que transporte o material genético de interesse para que o mesmo possa ser reconhecido pelo organismo hospedeiro. Esse material carreador deve ser próprio do organismo hospedeiro para que o mesmo seja reconhecido e não rejeitado.

CÉLULA HOSPEDEIRA: célula onde o DNA recombinante será inserido. Deve ser competente para receber o DNA recombinante e permitir a clonagem (amplificação) ou expressão do mesmo.

→ Sua função nas primeiras etapas do processo de clonagem é receber e multiplicar as cópias do DNA recombinante, porém, também deve ser capaz de produzir a proteína desejada.

RECOMBINAR (BIOQUÍMICA): unir dois fragmentos de DNA que anteriormente não estavam juntos → formação de rDNAs.

DNA RECOMBINANTE: DNA alvo (inserto) inserido no DNA carregador (vetor).

→ A amplificação in vitro de um DNA recombinante é limitada. Uma estratégia para elevar o número de cópias do mesmo é a inserção dessa molécula em um hospedeiro (transformação) capaz de realizar a replicação, como uma bactéria.

ENZIMAS MODIFICADORAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

DNAs POLIMERASES

Catalisam o ataque nucleofílico do carbono 3’ do desoxirribonucleotídeo ao fosfato α ligado ao carbono 5’ do desoxirribonuceotídeo adjacente, atuando assim na polimerização das cadeias de DNA (catalisam a formação das ligações fosfodiéster).

→ A polimerização catalisada é guiada por uma fita molde, de acordo com as regras de pareamento de bases.

→ Necessitam de uma sequência de oligonucleotídeos iniciadores (primers) com o grupo –OH 3’ livre.

PROCESSIVIDADE: termo relacionado a quantidade de nucleotídeos que a enzima consegue adicionar sem se dissociar do molde. Quando maior for esse número, maior sua processividade.

FIDELIDADE: relacionada a atividade exonucleásica 3’ → 5’ (atividade de revisão), para garantir que o DNA sintetizado possua a sequência complementar fidedigna a seu molde.

→ Fragmento Klenow: enzima sem a subunidade de atividade exonucleásica 5’ → 3’.

Atividade de leitura de prova (proofreading): atividade 3’ → 5’ exonucleásica, de identificação e correção de nucleotídeos adicionados erroneamente. A DNA pol observa diferentes pontos estruturais do nucleotídeo e da dupla fita durante a polimerização, como a ausência da hidroxila na posição 2’ (desoxirribonucleotídeo), além do empacotamento da dupla fita consequente da adição, detectando assim erros e possibilitando a correção;

Atividade 5’ → 3’ exonucleásica: atividade que possibilidade a DNA pol de remover nucleotídeos já hibridizados, substituindo-os por novos, independe dessa sequência a frente dela estar correta ou não. Tais enzimas normalmente possuem baixa processividade. A enzima mais utilizada para tal é a DNA pol de E. coli. Esse tipo de atividade é encontrada, em eucariotos, na DNA polimerase I, que desfaz o primer colocado na fita de DNA na replicação (que são fragmentos de RNA);

Aplicações: PCR, construção de DNA recombinante.

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RNAs POLIMERASES

Sintetizam RNA utilizando os quatro ribonucleotídeos 5’-trifosfatados a partir de DNA. Não necessitam de primers.

DNAs LIGASES

Catalisam reações de condensação entre dois nucleotídeos próximos utilizando ATP, visto que o nucleotídeo que irá sofrer o ataque não possui as três moléculas de fosfato que forneceriam a energia para reação.

→ Nas células, a DNA ligase está envolvida com o reparo de quebras na dupla fita do DNA, não adicionando bases, apenas ligando-as.

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DNAs QUINASES

Enzima dependente de ATP, adiciona um grupo fosfato na extremidade 5’ livre.

DNAs FOSFATASES

Remove o grupo fosfato da extremidade 5’.

→ DNAs fosfatases e quinases são utilizadas para a inibição ou favorecimento da ligação entre extremidades, inserção de sondas radioativas (fosfato radioativo), etc.

TRANSCRIPTASE REVERSA

DNA polimerase dependente de RNA (encontrada em retrovírus) que catalisa a síntese de uma fita de DNA complementar (cDNA). Necessita de um primer (inserido na cauda poli-A).

→ Produção de bibliotecas de cDNA, quantificação da expressão genética.

DNASES E RNASES

Enzimas que quebram ligações fosfodiéster entre nucleotídeos e desfazem os polímeros de DNA e/ou RNA.

→ Descontaminação de DNA ou RNA indesejados.

NUCLEASES

EXONUCLEASES: removem nucleotídeos a partir das extremidades do DNA.

ENDONUCLEASES: reconhecem e quebram sítios (ligações fosfodiéster entre nucleotídeos) no interior do DNA.

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Enzimas que reconhecem e clivam (hidrolisam as ligações fosfodiéster) o DNA (endonucleases) de fita dupla em sequencias específicas (sítios de restrição) – processo também chamado de digestão. Os sítios de restrição são sequencias de normalmente 6 nucleotídeos de sequencias palindrômicas.