Métodos de Análise de Biomoléculas

Métodos de análises de proteínas.

Na aula, o foco é proteína, mas o princípio fundamental de aplica à todas as biomoléculas.

- Possuem propriedades físico químicas que as diferencia. (Ex: densidade, solubilidade (hidrofo/hidrofi), distribuição de cargas, estrutura/forma/tamanho, ponto de ebulição e evaporação, ponto isoelétrico).

- Numa mistura simples, em um pedaço de tecido qualquer é possível encontrar milhares de moléculas! Como separá-las?

Dicroismo circular: é uma forma de espectroscopia que faz uso da absorção diferenciada da luz polarizada. 2 principios: biomoléculas absorvem luz (por isos tem cores). E essa absorção é proporcional à concentração. A partir disso podemos definir como é o gráfico de absorbância de proteínas conhecidas, se a estrutudar é alpha, folha beta...

Estrutura tridimensional: Se eu vejo td em uma onda muito grande, se a roda roda rápido, eu vejo só uma coisa,. difração de reios x: se eu quero ver coisas mto pq (átomo), preciso de uma onde MUITO pequena. A emissão de raio x tem um comprimento de onde muuuito menor que as outras, é por isso que pega tudo. Até a estrutura tridimensional (?)

Para fazer um fármaco: 1 purifico 2 descubro a estrutura 3 encontro uma biomolécula que se enconcaixa no sitio ativos, inibindo compet. 4 descubro a estrutura do substrato e imito ele.

1 Estrutura da amostra purificada: vinil agulhinha detecta coisas diferentes e pa converte em som. A oxilaçaõ do laiser que passa por cima da amostra transforma isso em imagens. Isso é para determinar a estrutura tridimensional da prot.

Purificar

Fracionamento por precipitação: frio/calor. Saltind-in/salting-out. Solvent organico. Solucoes de diferentes PH.

Levedo. Massero. Vai monitorando as fazes de fracionamneto e avaliando se a reação continua acontecendo. Tipo, se o filtrado faz produto, então a proteína ta ali. Se o liq .. é pq ta ali

Detecção

Grupos funcionais determina a reatividade /capacidade de reagir das biomoléculas

Algumas cores: branca n absorve luz. Preta: absorve tudo.

Técnicas q identificam anéis aromáticos/lig peptídicas;

Principal técnica: Espectofotometria: um gel de uma concentração partícula e coloco nas laterais um eletro. Se coloco uma amostra , as cargas vao migrar, aí vai fazer uma escala de cor. Mais finas passam rapidinha. Mais grossas passam de forma retardatária. Logo, a separação aí é por tamanho e não por carga. A: amostra original mto grossa. B: amostra separada por eletroforese: varias bandinhas com espessuras diferentes. Bandas maiores: proteínas maiores. Bandas menores: proteínas menores. Sobre a massa: faço um padrão de proteínas com massas já conhecidas. Na amostra, comparo e tenho noçaõ da massa da amostra.

Tecnica de zimograma: verifica a tividade enzimática em um gel de agarose? Coloca um substrato q age com uma so enzima daquela tabela (gel) de bandagem, o q mudar de cor (reagir) plau, é essa proteína que eu quero q age com esse substrato.

Isoeletroenfoque, focalização isoelétrica: Gel para separação por ponto isoelétrico, este gel possui

Eletrofose bidimensional (Ponto isoelétrico + massa)> masserei, coisa com mta biomoléculas>faixa com pqs diversos... as moléculas que se ligarem na parte mais +, é o seu ponto isoelétrico, --, é o seu ponto isoeetricio (separação por ponto isoelétrico.) posteriormente,  é feita a separação por massa> passa a amostra separada por ponto isoelétrico por um gel com poros diferentes. Aí sei a massa. Escaneia isso no laboratório e faz o resultado. Compara dois resultados diferentes . ex: se em a eu não coloquei o substrato e em B eu coloquei o substrato e no gel final há uma proteína (pontinho) diferente, então eu consigo saber que é aquilo que mudou na reação.. começo a estudar aquela reação espeífica. Mais cada pontinho pode ser duas, pq duas prot podem ter a mesma massa e o mesmo ponto isoeletrico