Protocolo e respostas aula prática - Enzimas

Protocolo de aula prática – Atividade Enzimática

1. Objetivos

1. Entender como funciona um método enzimático espectofotométrico;
2. Observar a relação entre a quantidade de enzima e a atividade enzimática;
3. Observar a relação entre a quantidade de substrato e a atividade enzimática;
4. Exercitar cálculos para determinação da atividade enzimática.

1. Princípio do método

A acetilcolinesterase (ChE) cliva o acetato de acetilcolina, liberando tiocolina. A tiocolina reage com o DTNB formando um dissulfeto misto e liberando o TNB, que absorve no comprimento de onda 412 nm e com um coeficiente de extinção molar de 13.600 M.cm-1. O DTNB reage com tióis especificamente, tais como glutationa (GSH), cisteínas (Cys) ou tióis de proteínas.

RELAÇÃO COM SUBSTRATO NATURAL → NA CÉLULA

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RELAÇÃO COM SUBSTRATO ARTIFICIAL

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MÉTODO DE DETECÇÃO

Tiocolina reage com DTNB gerando o tionitrobenzoato que é colorido (amarelo). O aparelho lê a intensidade da luz (412 nm) absorvida pela solução.

[pic 3]

Analytical Biochemistry Volume 408, Issue 2 2011 212 - 219

1. REAGENTES

1. Solução de fosfato de potássio 0,25 M, pH 8,0
2. MIX - DTNB (ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico)) – 5 mM (1,67 mg/mL diluído em fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,0)
3.  ATC - Iodeto de acetiltiocolina – 9mM ( 2,62mg/mL diluído em água)
4. AMOST-Amostra: extrato de tecido com atividade Acetilcolinesterase

1. ENSAIO

Pipetar o volume (µL) das soluções conforme indicado na tabela a seguir. Cada poço terá MIX + AMOST (ENZ) + ÁGUA, ou MIX + AMOST + ÁGUA. Pipetar na ordem indicada.

[pic 4]

[pic 5]

1. Adicionar 10µL de substrato (S) na coluna1;
2. Adicionar 20 µL de enzima na coluna 2.
3. Fazer a leitura em 412nm no leitor de placas por 6 minutos.

1. CÁLCULO

1. Obter o delta de absorbância por minuto (ΔAbs/min) obtido do aparelho.
2. Montar um gráfico relacionando o delta de absorbância x concentração de amostra ou enzima (dependendo da coluna).

1. RESULTADOS ESPERADOS

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Gráfico A

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Gráfico B

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1. Explique o que acontece em cada gráfico. Qual é a relação dentre o aumento na concentração de amostras (enzimas) e de absorbância? Porquê no gráfico A há formação de uma reta e no gráfico B uma hipérbole? Explique.

Em ambos os gráficos, a absorbância da solução aumenta conforme aumenta a concentração de amostra (A) ou substrato (B). Ao aumentar a quantidade de enzima, a reação enzimática será favorecida e dessa forma aumentará o produto por ela gerado que será identificado através da absorbância. Por que no gráfico A, a quantidade de amostra aumenta linearmente de acordo com o tempo, de forma proporcional, sendo a relação entre amostra e tempo de primeira ordem. E o gráfico B é de segunda ordem no início da reação e conforme ocorre a saturação da reação se torna de ordem zero, dessa forma a relação não é proporcional e constante.

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