A Coloração de Ziehl-Neelsen

                   Coloração de Ziehl-Neelsen

  O método de Ziehl-Neelsen é tradicionalmente usado em laboratórios para o diagnóstico de micobacterioses devido à sua simplicidade e rapidez. Quanto ao diagnóstico da paratuberculose, a visualização de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) em esfregaços corados mediante a técnica de Ziehl-Neelsen a partir de amostras de fezes, mucosa intestinal ou gânglio linfático.
 A paratuberculose, ou doença de Johne, é uma doença de natureza infecciosa causada por Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis. Atinge principalmente os ruminantes, originando uma enterite crônica granulo matosa.       Nos casos mais avançados da doença, o diagnóstico não oferece nenhuma dúvida, uma vez que os bacilos são muito abundantes e adotam uma disposição característica em grumos, devido à manutenção da estrutura que têm no interior dos macrófagos. Nos casos em que a quantidade de bacilos é menor, o diagnóstico torna-se mais difícil, na medida em que a amostra que se examina ao microscópio pode não permitir a visualização da micobactéria devido ao fato de ser em pequena quantidade. 

São características do gênero:

- Aerobiose estrita.

- Reprodução lenta, mesmo em condições ótimas (seu período de duplicação é de 12 a 18 horas enquanto outras bactérias podem se duplicar em 20 minutos).

- Reações tintoriais próprias que as fazem conhecidas com álcool-ácido-resistentes (B.A.A.R.) evidenciadas pela coloração de Ziehl-Neelsen. Coram-se pela mistura fucsina mais ácido fênico aquecido, que penetra no citoplasma e resistem à descoloração com uma mistura de ácido e álcool.

- Grande resistência à ação dos agentes químicos, o que permite o seu isolamento em material contaminado com outros microrganismos.

- Exigência nutritiva: nos meios comumente usados (Lowenstein-Jensen e Petragnani, à base de ovo), o crescimento se dá após 12 a 15 dias, mas as culturas devem ser mantidas em observação por até 6 a 8 semanas. Antes da semeadura do material, se contaminado com outras bactérias, deve-se proceder à descontaminação. O isolamento do germe permite a sua tipificação, quer pelo aspecto da colônia desenvolvida (eugônica ou disgônica), quer por provas bioquímicas ou fagotipagem. Também o aspecto microscópico da colônia é importante (fator corda).

- Patogenia peculiar: o parasitismo é intracelular, levando a lesões que tendem à cronicidade, com aparecimento de hipersensibilidade do tipo tardio. Os anti corpos participam da imunidade que se desenvolve contra o microrganismo. M. leprae não é cultivável, sendo visível apenas em material colhido de paciente, com a disposição típica de globais (bacilos em forma de cachos, onde os bacilos se acham reunidos por uma substância de concentração não corável, a gléia). Entre as micobactérias atípicas, algumas são patogênicas para o homem.

Material para coloração de ziehl-neelsen

- Lâminas com esfregaço de escarro baculífero de paciente tuberculoso.

- Bateria de corantes de Ziehl-Neelsen.

- Fucsina: Dissolver 3g de fucsina básica em 10 ml de etanol 90%-95%, em seguida adicionar 90 ml de uma solução aquosa de fenol a 5%.

- Álcool

– ácido: Adicionar 3 ml de HCl concentrado em 97 ml de etanol a 90%-95%. –

 Azul de Metileno: Dissolver 0.3 g de azul de metileno em 100 ml de água destilada.

- Cobrir a lâmina, previamente fixada pelo calor, com fucsina fincada. Aquecer até a emissão de vapores, sem deixar o corante secar, por 3 a 5 minutos.

- Lavar em água corrente.

-Em seguida descorar completamente com álcool-ácido.

- Lavar em água corrente novamente;

- Contra corar com azul de metileno por 30 segundos.

- Lavar em água corrente novamente.

- Examinar a lâmina ao microscópio com objetiva de imersão.

  Os B.A.A.R apresentam-se como bastonetes finos, corados em vermelho, sobre fundo corado em azul. O resultado do exame de escarro corado pelo Ziehl-Neelsen pode ser dado conforme a seguinte tabela do Serviço Nacional de Tuberculose:

Negativo Ausência de B.A.A.R. em 100 campos microscópicos (CM).