A COLORAÇÃO DE GRAM E ZIEHL-NEELSEN

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COLORAÇÃO DE GRAM E ZIEHL-NEELSEN

Relatório da aula prática da disciplina de microbiologia clínica correspondente ao 6º semestre do curso de Farmácia da Faculdade de Sinop, FASIPE-MT

INTEGRANTE: Maria Heloisa Barbieri de Souza e Gabriel de Castro

Sinop
2018

1. INTRODUÇÃO

        Coloração de Gram é uma técnica de coloração para diferenciação de microrganismos através das cores, para serem observados em microscópio óptico. A técnica recebeu este nome em homenagem ao médico dinamarquês Hans Cristian Gram.

        Por volta de 1884, Hans Gram observou que as bactérias, após serem tratadas com diferentes corantes, adquiriram cores diferenciadas.  Assim, as que ficavam roxas foram classificadas de Gram-positivas, e as que ficavam vermelhas, foram chamadas de Gram-negativas. Essa técnica é fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias, sendo muito utilizada atualmente, como técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia.

        Há bactérias que são resistentes à coloração, mas que uma vez coradas vão resistir fortemente à descoloração, mesmo por ácidos fortes diluídos e álcool absoluto. Às bactérias que possuem esta propriedade são chamadas de ácido-álcool resistentes (gêneros Mycobacterium e Nocardia). Esta característica é devida ao elevado teor de lipídios estruturais na parede celular destas bactérias, que provoca uma grande hidrofobicidade, dificultando a ação dos mordentes e diferenciadores de corantes aquosos. A técnica de Ziehl-Neelsen evidencia esta ácido-álcool resistência.

        O diagnóstico das Micobactérias patogênicas (Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae), por bacterioscopia direta é feito através do método de coloração de Ziehl-Neelsen, o qual utiliza a característica destas bactérias de possuírem paredes celulares com alto  teor de lipídeos, que quando tratadas pelo corante fucsina fenicada, coram-se de vermelho e persistem ao descoramento subseqüente por uma solução de Álcool-ácido forte (diferenciador). É por isto que são conhecidas por bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR). As outras  bactérias, que não possuem tais paredes celulares ricas em lipídeos, têm a sua coloração pela fucsina descorada pela solução de álcool-ácido e coram-se em azul pela coloração de fundo do Azul de metileno (contra-corante).

2. OBJETIVO

        Observar e diferenciar bactérias Gram positivas e Gram negativas, de amostras de placas de bactérias pertencentes à Faculdade Fasipe, através do método de coloração de gram. E de escarro e células epiteliais retiradas da mucosa bucal do professor Cezar Ernani, através do método de coloração de Ziehl-Neelsen.

3. MATERIAL E MÉTODO

Foram utilizadas placas bacteriológicas pertencentes ao acervo da disciplina de Microbiologia do curso de Farmácia da Faculdade Fasipe de Sinop e, foram analisadas as imagens através de microscópios ópticos nas objetivas 4x, 10x, 40x e 100x.

Foram também utilizados os seguintes materiais para realização da coloração de gram: Lâmina para microscopia, alça de platina, óleo de imersão, microscópio, bico de Bunsen, cristal violeta, lugol, safrina, álcool, água destilada, além dos EPI’s (touca, máscara, luva e jaleco).
        Para a coloração de Ziehl-Neelsen, foram utilizados: Fucsina, solução de álcool-ácido, azul de metileno, bico de Bunsen, alça de platina, lámina, água destilada, vela, papel toalha e os EPI’s (touca, mascara, luva e jaleco).

Confecção da coloração de gram: Flambou-se a alça de platina, resfriou-se em um tubo com solução salina. A partir daí todo procedimento foi realizado próximo da chama do bico de Bunsen. Em seguida, retirou-se uma amostra da cultura com a alça e foi depositado no centro da lâmina, onde esse material foi espalhado com a alça em movimentos circulares em um só sentido, obtendo-se assim um esfregaço uniforme e fino. Após fixou-se o esfregaço passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando (amaçando) a chama três vezes, para que o material fique bem aderido.
Em seguida, a lamina foi levada para coloração e passou pelos seguintes passos:
1- Cobriu-se a lâmina com cristal violeta foi deixado agir por 1minuto.
2- A lâmina foi lavada em jato fraco de água de forma corrente, dos dois lados.
3- Cobriu-se então após lavagem da lâmina com lugol, onde foi deixado agir por 1 minuto e depois foi lavada novamente a lâmina no mesmo procedimento anterior.
5- Cobriu-se a lâmina com álcool, e esperou-se 20 segundos e lavou-se bem a lâmina.
6- Cobriu-se a lâmina com safranina e foi deixado agir por 30 segundos, e, novamente lavou-se a lâmina.
Após a lâmina foi secada do lado oposto ao esfregaço com um papel toalha e, em seguida levada ao microscópio, onde foi primeiro observada na objetiva de 10x para se ter uma visão se tem esfregaço ou não. E depois de observada na objetiva de imersão.

        Confecção da coloração de zieelh- neelsen: Flambou-se a alça de platina, resfriou-se em um tubo com solução salina. A partir daí todo procedimento foi realizado próximo da chama do bico de Bunsen. Em seguida, retirou-se uma amostra do escarro com a alça e foi depositado no centro da lâmina, onde esse material foi espalhado com a alça em movimentos circulares em um só sentido, obtendo-se assim um esfregaço uniforme e fino. Após fixou-se o esfregaço passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando (amaçando) a chama três vezes, para que o material fique bem aderido. Em seguida:
1- Cobriu-se a lamina com fucsina fenicada, deixando agir por cerca de cinco minutos, aquecendo brandamente utilizando uma vela por baixo da lâmina, até que se produza emissão de vapores e, quando estes são visíveis, cessar o aquecimento.
2- Repetir essa operação ate completar três emissões sucessivas.
3- Lavou-se em água corrente de jato fino para eliminar a fucsina.
4- Cobriu-se a superfície do esfregaço com a solução de álcool-ácido.
5- Tomou-se a lamina em movimento de vai-e-vem, de modo que o álcool-acido vá descorando suavemente a fucisina, até ficar em um tom ligeiramente rosado. Essa operação dura cerca de dois minutos.
6-Terminada a fase de descoloração e eliminado o álcool-ácido, lavou-se a lâmina da mesma forma como se procedeu depois da coloração com a fucsina;
7- Foi coberto toda a superfície do esfregaço com solução de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto;
8- Lavou-se novamente em água corrente.
9- Observou-se ao microscópio com objetiva de imersão (100 x).