O Teste de Pirogênio

Teste de Pirogênio

Introdução

Todos os produtos injetáveis de uso humano devem ser livres de pirogênio.  Este contaminante é considerado um grave problema de saúde pública, pois pode causar febre, podendo levar o paciente a um quadro de choque ou até ao óbito. O teste de pirogênio é realizado em coelhos, principalmente no controle de soros, dos problemas éticos e do alto custo na utilização de animais, o teste em vacinas e hemoderivados, embora ensaios de LAL (Lisado de Amebócito de Limulus) e MAT (Teste de Ativação de Monócitos) sejam considerados como alternativas para determinados produtos.

Teste de Pirogênio In Vivo

        O teste de pirogênio in vivo fundamenta-se na observação da resposta febril em coelhos, após injeção intravenosa da solução em análise, na qual se mede a temperatura retal dos animais a intervalos de 30 minutos, por um período de 3 horas. Um primeiro teste é realizado com três animais e, caso o resultado seja duvidoso, cinco novos coelhos são testados para se ter o resultado final. No primeiro caso, se nenhum coelho apresentar um aumento individual de temperatura de 0,5 °C ou mais, acima da respectiva temperatura de controle, o produto atende aos requisitos para ausência de pirogênio. Na repetição, se no máximo três dos oito coelhos mostrarem aumentos individuais de temperatura de 0,5 °C ou mais, e se a soma dos oito aumentos máximos individuais não exceder 3,3 °C, o produto atende aos requisitos para ausência de pirogênio (WILLIAMS, 2007). Cabe ressaltar que coelhos apresentam o mesmo limiar de endotoxina que causa febre no homem, ou seja, 1 ng/kg ou 5 UE/kg (HOCHSTEIN, 1990).

Teste de Pirogênio In Vitro

        Existem diversos métodos de LAL, entretanto, os mais utilizados são o de gelificação e cromogênico. No primeiro caso, volumes iguais do reagente LAL e da solução a ser analisada são homogeneizados e incubados em banho-maria a 37ºC por uma hora (FUKUMORI, 2008). A presença do gel que se mantém sólido durante a inversão é considerada positiva para endotoxinas. Nesse método, obtém-se, somente, uma medida semiquantitativa, uma vez que o resultado é expresso em faixas (PRESGRAVE, 2003). No LAL cromogênico, um substrato cromóforo é incorporado ao complexo endotoxina-LAL resultando em reação de cor, diretamente proporcional à quantidade de endotoxina (FUKUMORI, 2008). Esse método permite uma quantificação precisa da quantidade de endotoxina presente na solução testada. Existem outros métodos descritos na Farmacopeia que também proporcionam informações acerca da concentração de endotoxina nas amostras, entre eles, turbimétrico quantitativo, colorimétrico de proteína e nefelométrico (WILLIAMS, 2007; FUKUMORI, 2008).

        A primeira demonstração da aplicação da liberação de citocinas in vitro foi através do “teste do monócito”, em comparação com os ensaios em coelho e LAL. Nesse método, uma linhagem celular monocítica humana denominada MONOMAC-6 (MM6) foi submetida à presença de endotoxinas de diversas origens e as citocinas (IL-1 e TNF) foram dosadas demonstrando uma boa relação dose-resposta (POOLE et al., 1988; ZIEGLER-HEITBROCK et al., 1988).

O procedimento mais simples e amplamente usado para a detecção de endotoxinas basea-se na gelificação. Volumes iguais de reagente LAL e da solução a ser analisada são transferidos a tubos de ensaio. A mistura homogeneizada é incubada em banho de água a 36°C por uma hora. O ponto final da reação é facilmente verificado pela remoção dos tubos e inversão a 180º.         A presença do gel que se mantém sólido durante a inversão é considerada positiva para endotoxinas. O ensaio se constitui em teste limite, levando-se em consideração a sensibilidade do LAL empregado, que varia de 0,25 a 0.015 UE ml -1. (UE = Unidade de Endotoxina).

O método se baseia na reação entre os amebócitos e a endotoxina, produzindo um gel opaco e facilmente reconhecido.

O reagente LAL é um extrato aquoso dos amebócitos, que são as células sanguíneas da hemolinfa azul da espécie de caranguejo ferradura Limulus polyphemus, composto de enzimas que reagem em presença de pequenas quantidades de endotoxina.

O Limulus habita em alguns locais na costa do Oceano Atlântico dos Estados Unidos até o Golfo do México.

Na preparação do lisado do amebócito de Limulus (LAL), os caranguejos são submetidos à  sangria introduzindo-se a uma agulha através do músculo entre as regiões cefalo-torácica e abdominal. A hemolinfa é então submetida aos processos de estabilização e purificação para obtenção dos amebócitos.

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