PROVAS BACTERIANAS

Provas de identificação bacteriana

As características morfológicas da bactéria são essências para fazer a identificação das bactérias. Sendo os estreptococos Gram positivos em arranjo de cadeia longa e os estafilococos Gram positivo em cachos de uva. A identificação começa com a incubação primaria na placa de ágar de sangue de carneiro que deve ser incubada em 5% de tensão de CO2.

Prova de catalase: Com a alça bacteriológica ou com um palito coleta-se o centro de uma colônia suspeita e esfrega-se em uma lamina de vidro. Colocar sobre este esfregaço uma gota de água oxigenada a 3% e observar a formação de bolhas. Staphylococcus spp tem catalase positiva, ou seja, há formação de bolhas ou efervescência e Streptococcus tem catalase negativa.

Provas de identificação dos Staphylococcus ssp

Características de estafilococos em ágar de sangue:

As colônias são grandes e convexas com coloração branco-porcelana a amarelo, podem apresentar hemólise ou não.

Identificação das espécies de Staphylococcus aureus

A prova mais simples para a identificação é a prova de coagulase que pode ser efetuada em tubo ou em lâmina.

Coagulase em lâmina: A espécie de Staphylococcus aureus possui  fator aglutinante na sua superfície da parede celular, onde reage com o fibrinogênio do plasma causando coagulação do  mesmo.  

Colocar 2 gotas de salina em um lâmina;

Emulsionar uma colônia isolada a ser testada;

Colocar uma gota de plasma e misturar com um palito de plástico ou madeira;

Observar se há aglutinação em 10 segundos;

Obs: Não se pode executar este teste a partir de um ágar com grande concentração de sal como ágar manitol.

Teste da Coagulase em Tubo: Baseia-se na presença da coagulase livre que reage com um fator plasmático onde forma um complexo que atua sobre fibrinogênio formando fibrina.

Adicionar 0,1 ml de caldo BHI, incubado por uma noite, com colônia suspeita a um tubo de ensaio com 0,5 ml de plasma;

Incubar por 4 horas à 35°C em estufa ou banho maria;

A formação do coágulo é observada pela inclinação suave do tubo de ensaio a 90 graus da vertical.

Teste da DNAse: Consiste na inoculação de colônias em meio contendo DNA, obtido comercialmente.

Adicionar ao meio original azul de ortotoluidina na concentração de 0,1%; o meio adquire uma coloração azul intensa;

Incubar a 35°C por 24 horas;

Um coloração rósea características ao redor das colônias produtoras de DNAse indica a positividade da prova;

Crescimento em ágar de manitol

O staphylococcus aureus tem a capacidade de fermentar o manitol em meio contendo 7,5% de cloreto de sódio, denominado ágar manitol salgado. O indicador de pH é o vermelho de fenol, que indica uma reação positiva quando o meio das colônias se torna amarelo, e negativa quando permanece avermelhado.

Manitol positivo: formação de halo amarelo

Manitol negativo: não há formação de halo, meio incolor.

Os Staphylococcus sp se dá pela coloração de Gram, pela pigmentação de suas colônias (amarelas, róseas ou alaranjadas).

Teste de resistência a novobiocina (5µg):  usada para identificar as espécies de Staphylococcus ssp de coagulase negativa.

Sensível: tem halos de inibição, ≤  16mm.

Resistente: sem halo

Prova de uréase (meio uréia de Christensen): analisar se a bactéria é produtora de enzima uréase.

Uréia positiva: cresce e o meio fica pink

Ureia negativa: cresce e o meio fica amarelo

Prova de ornitina: analisar se a bactéria faz descarboxilação da ornitina

Ornitina positiva: meio fica roxo

Ornitina negativa: meio fica amarelo.

Prova de coagulase: a proteína coagulase produzida pela bactéria reage sobre o fibrinogênio no plasma e forma rede de fibrina. Coagulase positiva: formação de coágulo identifica Staphulococcus aureus e Coagulase negativa: não há coágulo, identifica outras espécies de Staphylococcus.

Identificação de espécies de Streptococcus ssp

Colônias pequenas puntiformes, algumas espécies apresentam hemólise são anaeróbios facultativos e não são produtores de catalase e de citocromo-oxidade.

Os Streptococcus podem ser diferenciados de acordo com sua aparência na placa de ágar sangue, em 5% de CO2. Podendo apresentar:

Hemólise beta: lise total dos eritrócitos (cor transparente)

Hemólise alfa: lise parcial dos eritrócitos (cor esverdeada)

Hemólise gama: não ocorre hemólise.

Teste de CAMP         

Proteína “Fator CAMP” reage com a hemolisina produzida pelo S. aureus, causando um sinergismo das hemólises.  Esses teste podem ser testadas em um mesma placa de ágar sangue devendo ficar a 1mm de distância.

CAMP positivo: ocorre um aumento da zona de lise na área de intersecção entre as sinergismo formando um ponta de flecha.

CAMP negativa: não há sinergismo entre as hemólises.

 Teste do PYR

É uma enzima produzida pelo Streptococcus pyogenes. Esse teste é tercnicamente, equivalente à prova da hidrolise da bile esculina e crescimento em 6,5% de NaCl. O substrato é hidrolisado, liberando B-naftilamida, formando um composto cor pink.

PYR positivo: pink

PYR negativo: amarela.

Identificação das espécies de Streptococcus ssp beta-hemoliticos

S. pyogenes: Sensível para Bacitracina, positivo para PYR e negativo CAMP

S. agalactiae: Resistente para Bacitracina, negativo PYR e positivo CAMP

S. grupo C, F, G: Sensível/ Resistente para Bacitracina, negativo PYR e negativo CAMP.

Indetificação de Streptococcus alfa-hemotitico

Não é feita por métodos sorológicos, pois a maioria não possui antígenos de Lancefield.

Teste da optoquina (5 µg  – Cloridrato de etil hidrocupreina) : optoquina lisa a parede de S. pneumoniae impedindo seu crescimento.

Positivo: formação de halo de inibição, ≥  14mm.

Negativo: não há formação de halo.

Identificação de Streptococcus gama-hemoliticos

Podem não apresentar nenhuma hemólise.