Extraçao Dna

Patologia Molecular

Extração DNA

Diversos métodos para extração de DNA a partir de tecidos biológicos inclusos em parafina encontram-se descritos na literatura, sendo o sucesso desse procedimento de grande importância para a realização de métodos moleculares de diagnóstico empregando a reação em cadeia da polimerase (PCR).

O método mais utilizado para purificação do DNA é a extração com fenol tamponado, que provoca a desnaturação das proteínas de maneira eficiente. O clorofórmio também é usado como agente desnaturante das proteínas contidas na amostra. A mistura de fenol e de clorofórmio é muito eficiente para desproteinizar e sua ação se fundamenta na propriedade hidrófoba das proteínas que apresentam afinidade por solventes orgânicos. O álcool isoamílico previne a formação de espuma quando a mistura é agitada, o que torna mais fácil a separação da fase orgânica e da fase aquosa. A proteína que foi desnaturada pelo tratamento com fenol e clorofórmio forma uma camada na interface das duas fases, separando-se do DNA que se mantém na fase aquosa. Assim, esse método usa produtos químicos orgânicos tóxicos, que requerem múltiplas centrifugações, podem resultar em uma perda significativa de material e introduzirem inibidores de amplificação; Além disso, a manipulação de soluções que contêm fenol exige cuidado, pelo fato de serem extremamente cáusticas, voláteis e irritantes para as mucosas. A tecnologia baseada em sílica é muito empregada nos kits atuais, o DNA adsorve especificamente a membranas/superfícies/partículas de sílica em presença de certos sais e em um determinado pH. Os contaminantes celulares são removidos por etapas de lavagens e o DNA pode finalmente ser eluído em um tampão com baixa concentração de sal ou em um tampão de eluição. Sais caotrópicos são adicionados para ajudar na desnaturação das proteínas e extração do DNA. A vantagem desta tecnologia é que ela pode ser incorporada em spin columns e micro chips, é rentável, tem um procedimento simples rápido (comparado com a extração orgânica) e pode ser automatizada. Além disso, não utiliza reagentes cancerígenos como o fenolcloroformio. Todavia, os primeiros protocolos com coluna de sílica necessitavam de uma grande quantidade de material ósseo, grande volume de reagentes e todos os procedimentos eram realizados manualmente.

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