Lipase pancreatica

1. Introdução teórica

        A lipase pancreática é a enzima responsável pela digestão dos triacilglicerois (TAG), pois catalisa consecutivamente a hidrolise das ligações éster nas posições 1 e 3 do glicerol no TAG, dando origem a dois ácidos gordos livres e 2-monoacilglicerol.

Na presente aula, utilizaremos a pancreatina, um extrato pancreático liofilizado como fonte da enzima. Os triacilglicerois com ácidos gordos de cadeia longa são muito pouco solúveis em água, logo torna-se necessário utilizar uma emulsão para uma ação enzimática satisfatória.

In vivo o processo emulsificativo é iniciado pela bílis e é intensificado pelos produtos intermediários e finais da digestão lipídica, particularmente monoacilglicerois e ácidos gordos, que são compostos antifáticos. In vitro pode-se preparar um substrato para a lipase pancreática por emulsificação ultrassónica de um óleo alimentar em água ou detergente. In vivo, produtos de digestão lipídica associam-se intermediariamente com sais biliares, formando as chamadas micelas mistas, que depois são absorvidas pela mucosa intestinal, por um processo de simples difusão.

Segundo o princípio de le Chatelier esta remoção contínua dos produtos favorece a sua formação, permitindo assim a hidrolise completa do substrato.

Nessa experiencia simula-se o efeito por adição de um excesso de iões de cálcio que precipitam os ácidos gordos libertos pela enzima, afastando assim um dos produtos finais do meio da reação, alem disso, os iões de cálcio são um co-fator e estabilizador da lipase pancreática.

        

1. Objectivos

• Observar a atividade da lipase pancreática quando factores que afetam a sua funcionalidade são adicionados ou removidos da reação.
• A variação da actividade da lipase pancreática nos tubos

1. Princípios dos métodos

Observando a equação da reação da lipase pancreática, evidencia-se que a enzima liberta a partir de um substrato neutro (triacilglicerol) produtos ácidos (ácidos gordos), portanto a medição da velocidade de diminuição do pH, acompanhando a ação da enzima, pode ser correlacionada com a actividade enzimática, porém e mas favorável determinar a quantidade de uma solução alcalina que deve ser adicionada passo a passo, ao longo do tempo da reação para neutralizar os ácidos gordos. Assim o pH mantém-se por volta do pH ótimo da enzima, não há alterações da actividade enzimática em função do pH e consequentemente o resultado é mais exacto.

1. Materiais e reagentes

• Tubos de ensaio
• Banho maria
• Bico de bunsen
• Sol. De NaOH 0.01e 0.1M
• Fenolftaleína (2% em etanol)
• Cloreto de cálcio 0.1M
• Tampão de amónio (0.05M pH 8)                                    
• Pancreatina (0.5g/75ml de tampão de amónio)
• Óleo alimentar (50g)
• Água (qbp 100g de emulsão)
• Detergente

1. Procedimentos

• A emulsão foi preparada com 8ml de H2O, 2ml de óleo e 1ml de sabão líquido.
• São adicionados a 8ml de solução de pancreatina contendo 2 gotas de fenolftaleína, gota a gota uma solução de NaOH 0.1 até que a solução mude de cor (rosa pálida).
• São preparados tubos de ensaio de acordo com a tabela a baixo:

Tubo Nº	1	2	3	4	5
Pancreatina (ml)	1.5	0.75	1.5	1.5	1.5
Tampão (ml)	0.0	0.75	0.0	0.0	0.0
CaCl2 (ml)	1.0	1.0	1.0	0.0	1.0
Água destilada (ml)	0.0	0.0	0.0	1.0	0.0
Emulsão (ml)	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5

• O tubo 5 foi fervido na chama de bunsen e depois arrefecido.
• O tubo 1 foi colocado num banho com gelo.
• Depois de terminar as preparações iniciais adicionaram-se rapidamente 0.5ml da emulsão, agitou-se o tubo e iniciou-se a cronometragem.
• Observou-se os tubos durante 15 minutos, anotou-se o tempo de mudança de cor.

1. Resultados

Tubo Nº	1	2	3	4	5
Cor depois da adição da emulsão e dos 15’	Mudou no minuto 12	Não mudou	Mudou no minuto 6	Mudou no minuto 11	Não mudou

1. Discussão e conclusão

O tubo 1, que contém as mesmas soluções que o tubo 3, e estava na água gelada, após 12 minutos, foi possível verificar uma ligeira mudança, visto que o tubo 3 apresentou alterações depois de 6 minutos. Os dois tubos diferiram nos resultados devido aos ambientes em que foram expostos, o tubo 1 foi exposto a um banho com água gelada e esta baixa temperatura diminuiu a velocidade e ação enzimática da lípase pancreática e no tubo 3 como estava a temperatura ambiente a reação foi um pouco rápida. O tubo 2, devido a presença da solução tampão, teve maior atividade enzimática, pois a solução tampão, criou mecanismos de tornar o meio em que decorria a reação favorável sem mudança ou desequilíbrio do meio ácido-base, pois na reação de hidrólise dos triglicéridos que forma ácidos gordos e glicerol, o meio tende a tornar-se ácido o que baixaria o ph, porque nesta reação de hidrólise ocorre com libertação de H+ que tornaria o meio com excesso de H+, tornando muito acido o que interfere com a atividade enzimática da lípase.

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