Estudo de Lipase

INTRODUÇÃO

Lipases são enzimas pertencentes ao grupo das hidrolases onde atuam nas ligações éster. Agem sobre a interface óleo-água catalisando a hidrólise de ligações éster-carboxílicas de acilgliceróis para liberar ácidos graxos e gliceróis. Elas se diferenciam das esterases por atuarem na presença de substratos insolúveis em água e emulsionados, agindo sobre triglicerídeos de longas cadeias de ácidos graxos. Já as esterases atuam sobre substratos solúveis em água, hidrolisando triglicerídeos de cadeias curtas de ácidos graxos.

No ambiente da natureza, as lípases são produzidas por vegetais, animais e microrganismos. Onde neste último pode-se destacar as bactérias, as lípases microbianas merecem destaque pelo fato delas apresentarem boa estabilidade, alta conversão de substrato em produto, ampla faixa de atuação em diferentes faixas de pH e temperatura, além de, na sua grande maioria, serem produzidas extracelularmente facilitando a sua obtenção. Devido a essas características, as lípases microbianas estão sendo amplamente aplicadas industrialmente.

As espécies de Bacillus desempenharam um papel importante e em expansão no desenvolvimento da microbiologia aplicada durante este século. As enzimas industriais, inicialmente usadas como auxiliares na digestão, mas depois no processamento de alimentos e outras aplicações, foram introduzidas no início do século XX. Bacillus amyloliquefaciens, na época confundido com B. subtilis, tornou-se a fonte dominante de α-amilase e hoje com B. licheniformis é responsável por grande parte da produção mundial total de enzimas industriais. Mais tarde, a evolução da biotecnologia incluiu a descoberta e produção de antibióticos nos quais o Bacillus deveria desempenhar uma parte relativamente pequena, mas importante.

Foi encontrado no óleo de coco características incomuns como biofilme e pontos escuros, sugerindo a presença de um microrganismo lipolítico. Através dessa observação, o trabalho tem como objetivo isolar, identificar e avaliar a produção de lípase de um microrganismo encontrado no óleo de coco. Através de testes de caracterização morfofisiológica do microrganismo, produção intra ou celularmente de lípases, teste de pH, atividade biológica e teor de surfactante.

METODOLOGIA

1ª ETAPA – identificação do microrganismo e estudo de lipase

Observou-se a presença de pontos escuros e biofilme no óleo de coco, a partir dessa observação buscou-se descobrir se o microrganismo é um produtor de lípase. Retirou-se uma alíquota do óleo de coco e inoculou no caldo Mueller Hinton (MH) para crescimento bacteriano e no caldo saboraund (SB) para crescimento fúngico. Após o incubamento notou-se o crescimento em ambos os meios. Foi de interesse da pesquisa a utilização da bactéria, microrganismo crescido no caldo M.H. e desse caldo semeou no Agar M.H. para o crescimento e identificação de bactérias diferentes caso houvesse mais de um tipo, porém houve crescimento característico de apenas uma bactéria.

A partir do crescido do ágar M.H. realizou-se testes de caracterização morfofisiológica da bactéria como coloração de Gram, teste de oxidase e teste de catalase. Baseado no artigo “Characterization of Lipase from Bacillus subtilis 1-4 and Its Potential Use in Oil Contaminated Wastewater”, desenvolveu-se um meio de enriquecimento caldo mineralizado de 100 mL de meio salino contendo 1,5mg FeSO4.7H2O, 0,47g KH2PO4, 0,1g MgSO4.7H2O, 0,001g CaCl2.2H2O, 0,0110g Na2HPO4, 0,4g NH4NO3, 0,001g MnSO4.4H2O em 100 mL de água destilada e contendo 2% de óleo de coco novo e de boa qualidade como única fonte de carbono.

Nesse meio mineralizado realizou-se um inóculo da cultura e deixou incubado em temperatura ambiente por 7 dias. Passado esse tempo, realizou-se um inóculo na proporção de 1:10 dessa amostra no meio mineralizado e deixou sob agitação por 3 dias. Depois as duas culturas, de 3 e 7 dias, foram transferidas para um tubo e foram centrifugadas por 30 minutos em 2.000 rpm resultando em precipitado e sobrenadante. Pressupõe-se que nesse sobrenadante tenha as lípases e o precipitado é a massa celular, depois foi feito a filtração das duas culturas no filtro milipore obtendo-se filtrados mais límpidos sendo a de 7 dias um pouco mais turvo que a de 3 dias.

Também baseado no artigo fez-se outro meio contendo 10,0 g de Trypton, 5,0 g de NaCl, 5,0 g de extrato de levedura, 15,0 g de Agar e 2% de óleo de coco, depois foi plaqueado e então foi realizado 4 poços no meio. Em uma placa foi pipetado 100uL por poço do filtrado da amostra de 7 dias, noutra placa foi pipetado nos poços a amostra de 3 dias. Em uma placa com o mesmo meio, porém sem poços foi semeados, com o auxílio de uma alça calibrada, em 4 pontos o precipitado da amostra de 7 dias e noutra placa o precipitado de 3 dias. E para observação do crescimento da colônia nesse meio, semeou-se em 4 pontos, também, a colônia crescida na placa de M.H., totalizando 5 placas que foram incubadas em 35°C por 48 horas.

A intenção de semear no meio com poços é para observar a formação de halo correspondente à presença extracelular de lípase, caso não haja a formação do halo o semeio em pontos servirá para observação do crescimento bacteriano presumindo-se, portanto, que a bactéria consome a fonte de carbono e produz as lípases, mas as enzimas ficam no meio intracelular.

RESULTADOS

1ª