Métodos De Diagnósticos Virais

Métodos de diagnóstico viral

1 INTRODUÇÃO

As doenças virais estão cada vez mais acometendo a população. A taxa de incidência de AIDS no Brasil, por exemplo, é de 20,2 casos por 100 mil habitantes, e, só entre os jovens, a prevalência do HIV passou de 0,09% em 1980 para 0,12% e, 2012, de acordo com o último Boletim Epidemiológico divulgado pelo Ministério da Saúde. Esses são só alguns dados sobre um dos milhares de vírus que circulam no ambiente.

Nas últimas décadas, o diagnóstico das infecções virais emergiu como uma importante ferramenta biomédica, contribuindo na identificação do patógeno e direcionando de forma efetiva o tratamento da infecção. Até recentemente, entretanto, a utilidade desses testes diagnósticos era muito limitada, uma vez que as técnicas utilizadas eram muito caras e lentes, os reagentes não estavam disponíveis e não se tinha ainda um tratamento eficiente para infecções virais.

Nesse contexto, o aperfeiçoamento dos métodos de diagnóstico é de extrema importância para facilita o reconhecimento do vírus e o tratamento adequado da infecção, o que reduz as chances de transmissão da doença.

2 MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO

Os esforços por parte de virologistas para estudar, compreender e erradicar os agentes causadores de doenças surgiu em conseqüência das infecções virais, tanto nos seres humanos quanto nas plantas. Os estudos dos vírus e de suas células hospedeiras serviram de base para muitos conceitos e ferramentas da biologia molecular.

O crescente uso dos métodos de diagnósticos se deve, primeiramente, ao aumento do número de pacientes sujeitos a infecções virais oportunistas devido à epidemia do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e ao sucesso dos transplantes de medula óssea e de órgãos. Outro fator que contribuiu pra esse aumento foi o desenvolvimento tecnológico, que tornou o diagnóstico rápido e preciso.

3 TIPOS DE DIAGNÓSTICO

O diagnóstico laboratorial das viroses é dividido em molecular, que inclui técnicas de identificação de vírus, e sorológico, que visa a demonstração direta de vírus, antígenos ou ácidos nucleicos virais em amostras clínicas.

3.1 Diagnóstico sorológico de infecções virais

As reações sorológicas são empregadas na identificação, detecção e quantificação de antígenos virais difíceis de serem isolados e cultivados em culturas de células,

Os estudos sorológicos também são utilizados na confirmação de uma suspeita clínica, na avaliação da resposta do anticorpo à infecção, na diferenciação de doenças agudas ou crônicas, e no estudo epidemiológico do comportamento de uma virose em uma dada comunidade.

3.1.1 Inibição da hemaglutinação

A reação de Inibição de Hemaglutinação é uma adaptação da técnica de diagnóstico de Hemaglutinação, que usa a capacidade de alguns vírus de aglutinar hemácias.

Neste caso, parte-se da ideia que os vírus que possuem esta capacidade podem induzir a formação de anticorpos reativos à hemaglutinina (proteína de superfície responsável pela hemaglutinação). Deste modo, é possível que se faça um ensaio com agentes virais conhecidos em contato com o sangue de um paciente. Em caso de haver a infecção por um agente viral específico, ocorrerá a ligação de anticorpos à proteína, o que leva a inibição da hemaglutinação, detectável visualmente.

3.1.2 Soroneutralização

O teste de neutralização pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos com base em seu reconhecimento e ligação ao vírus. O revestimento do vírus por anticorpos bloqueia sua ligação as células indicadoras. A neutralização envolve a inibição, pelo anticorpo, da infecção e dos efeitos citopatológicos do vírus em células de cultura e de tecidos.

Uma resposta de neutralização por anticorpos é específica para o vírus e a cepa, sendo freqüentemente desenvolvida com o início dos sintomas e persistindo por longos períodos. Algumas das desvantagens dessa reação são o tempo prolongado para se obter os resultados, as reações cruzadas existentes entre vírus antigenicamente relacionados, e a necessidade de grande número de culturas celulares para proceder à titulação dos soros a testar, uma vez que deve ser feita em duplicata ou triplicata.

3.1.3 Ensaio Imunoenzimático Adsorvente (ELISA)

O mecanismo utilizado no ELISA concentra-se na identificação de anticorpos capazes de reagir contra antígenos de um determinado patógeno. Para isso, proteínas dos virus (ou de outro tipo de organismo patogênico) são fixadas em placas de polipropileno (eletricamente carregadas). Estas placas sofrem, então, o processo de bloqueio, com um material capaz de ligar-se a placa, impedindo que os materiais posteriormente adicionados se liguem a ela; a ligação que pretende-se observar é especificamente com o antígeno em uso. Em seguida, uma amostra do soro do paciente é adicionada à placa, de modo que um paciente infectado com o patógeno em questão possuirá anticorpos reativos que se ligarão no antígeno fixado na placa. Há, então, um processo de lavagem, que tem o objetivo de garantir que apenas anticorpos ligados ao antígeno permaneçam no ensaio. Com isso, há adição de anticorpos tratados em laboratório capazes de se ligar aos anticorpos do paciente. Estes anticorpos secundários estão conjugados a uma enzima (geralmente fosfatases) que irá, no passo seguinte, após mais lavagens, reagir com um substrato adicionado à placa. Esta reação leva a formação de produtos corados, sendo a leitura feita em procedimento de espectrofotometria (quantificação da transmissão de um determinado comprimento de onda pelo líquido). Testes negativos tendem a apresentar reatividade nula ou muito baixa (podem ocorrer ligações cruzadas, sendo necessária a determinação de um “cut-off”, a partir do qual a leitura é considerada positiva).

3.1.4 Western-Blot

O teste de Western-Blot possui um princípio semelhante ao do ELISA, havendo, porém, elementos de diagnóstico molecular. Para a realização desta ferramenta, é necessário o isolamento de proteínas do patógeno através de eletroforese em gel de poliacrilamida.