Métodos imunológicos

Os métodos imunológicos desenvolvidos para quantificar a concentração de antígenos e anticorpos, por apresentarem grande sensibilidade e especificidade, tornaram-se técnicas padronizadas para pesquisa e aplicações clínicas. Entre esses métodos, um dos mais usados é o ELISA (Enzyme-linked immuno sorbent assay).

Nesse método, uma enzima, que reage com um substrato incolor para produzir um produto colorido, é covalentemente ligada a um anticorpo específico que reconhece um antígeno alvo. Se o antígeno estiver presente, o complexo anticorpo-enzima irá ligar-se a ele e a enzima catalisará a reação. Então, a presença de produto colorido indica a presença de antígeno. Trata-se de um método eficiente pois permite detectar quantidades de proteína da ordem de nanogramas (10-9 g).

No ELISA, deve-se selecionar um par de anticorpos, que podem ser monoclonais ou policlonais. O uso de anticorpos monoclonais resulta em maior especificidade.

Dentre os diversos tipos de ELISA, destaca-se o ELISA SANDUÍCHE. Nesse método, o anticorpo de um antígeno particular é, inicialmente, adsorvido no well. Depois, o antígeno (soro, urina ou outra solução contendo o antígeno) é adicionado e se liga ao anticorpo. Finalmente, um segundo e diferente anticorpo ligado à enzima é adicionado. Nesse caso, a intensidade da reação é proporcional à quantidade de antígeno presente. Logo, permite mensurar até pequenas quantidades de antígeno.

Quanto ao método de revelação, pode ser direto ou indireto. No primeiro, a enzima reveladora encontra-se ligada diretamente ao segundo anticorpo, enquanto no indireto, a enzima apresenta-se ligada a um anti-anticorpo.

O ELISA constitui a base do teste para infecção por HIV. Nesse teste, proteínas virais (os antígenos) adsorvem nos “poços” (wells) da placa de ELISA. Em seguida, é adicionado soro do paciente contendo anticorpos que se ligam aos antígenos. Finalmente, anticorpos ligados à enzima ligam-se aos anticorpos humanos, propiciando a reação enzimática com mudança de cor.

EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS:

 PLACA DE ELISA

 PIPETAS AUTOMÁTICAS

 LEITOR DE ELISA

 LAVADOR AUTOMÁTICO DE PLACAS

CUIDADOS:

 Data de validade e estocagem dos REAGENTES

 Processamento e estocagem das AMOSTRAS

 Evitar contaminação e espuma no PREPARO DE SOLUÇÕES

 CALIBRAÇÃO de pipetas e demais aparelhos

 LIMPEZA

PROCEDIMENTO PARA ELISA SANDUÍCHE:

 Coloca-se, na placa de ELISA, solução tampão contendo o primeiro anticorpo com concentração conhecida e suficiente para adsorver nos “poços” (“wells”) da placa. Em geral, a solução é saturada.

 Lavam-se os “poços” com tampão de lavagem, de forma a retirar o tampão, mas deixar o anticorpo aderido à placa.

 Adiciona-se solução contendo proteína de alto peso molecular, como a BSA