Salmonelas

O que são salmonelas

As salmonelas são bactérias Gram negativas não esporuladas e móveis pertencentes à família Enterobacteriáceas.

Espécies

Este gênero de bactéria apresenta-se em três espécies: Salmonella typhi, Salmonella choleraesuis e Salmonella enteridtis. Esta última apresenta mais de 1400 variações.

Com exceção da Salmonella typhi, quee afeta aos seres humanos provocando a febre tifóide, a maioria são patogênicas tanto para os homens quanto para os animais.

Doenças provocadas

Nos seres humanos as salmonelas são responsáveis por diferentes quadros clínicos (doenças provocadas) como a febre tifóide e paratifoidea, gastrenterite por salmonela, infecções localizadas, etc.

Fontes de transmissão

Entretanto, existem pessoas que podem sofrer quadro de infecção assintomática, ou, ainda, ser portadoras transitórias ou crônicas, sendo as responsáveis pela disseminação dos bacilos. As principais fontes de transmissão de salmonela são os alimentos contaminados.

Pesquisa de Salmonella sp. em alimentos

Metodologia Analítica Empregada

A metodologia descrita a seguir é a preconizada pela Food and Drug Administration (FDA – USA), publicada no Bacteriological Analytical Manual, 8ª ed.[1]

Esta metodologia é internacionalmente reconhecida e é uma alternativa à metodologia preconizada pela Instrução Normativa 62 do MAPA.

Índice:

1. Material necessário para análise

1.1. Meios de cultura

1.2. Equipamentos e outros materiais

2. Procedimento

2.1. Preparo das amostras

2.2. Fase de Pré-Enriquecimento das amostras

2.3. Fase de Enriquecimento seletivo das amostras

2.4) Fase de plaqueamento em meios seletivos

2.5) Confirmação preliminar das colônias de Salmonella

2.6) Testes sorológicos e bioquímicos para confirmação definitiva

1) Material necessário para análise

1.1 Meios de cultura

Pré-enriquecimento

- frascos contendo 225 mL de caldo lactosado

Enriquecimento seletivo

- tubos contendo 10 mL de caldo Rappaport Vassiliadis (RV)

- tubos contendo 10 mL de caldo Tetrationato (TT)

Plaqueamento diferencial

- placas de ágar Bismuto Sulfito (BS)

- placas de ágar Entérico de Hecktoen (HE)

- placas de ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD)

Confirmação (testes preliminares)

- tubos de ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI)

- tubos de ágar Lisina Ferro (LIA)

Confirmação (testes adicionais)

- tubos de caldo Uréia de Christensen

- tubos de caldo Vermelho de Fenol (0,5% Dulcitol)

- tubos de caldo Vermelho de Fenol (1,0% Lactose)

- tubos de caldo Vermelho de Fenol (1,0% Sacarose)

- tubos de caldo Triptona 1%

- tubos de caldo Malonato Modificado

- tubos de caldo VM-VP

- tubos de agar Citrato de Simmons

- tubos de caldo Descarboxilase de Moeller 1% Lisina

- reagente de Kovacs para teste de indol

- solução de Vermelho de Metila para teste de VM

- reagente de Barrit para teste de VP (solução de α – naftol 5%,

solução de KOH 40%, creatina em cristais)

- anti-soro somático polivalente (Poli O)

- anti-soro flagelar polivalente (Poli H)

1.2) Equipamentos e outros materiais

- sacos plásticos estéreis

- capela de fluxo laminar

- balança eletrônica

- homogeneizador de amostras (stomacher)

- aparelho medidor de pH

- estufa a 35ºC

- agitador de tubos

- banho-maria a 42ºC

- banho-maria a 43ºC

2) Procedimento

2.1) Preparo das amostras

Em um saco plástico estéril serão pesados assepticamente 25g de pele e de músculos das regiões do pescoço, peito, cloaca e asas das carcaças. A seguir serão adicionados 225 mL de caldo lactosado (M1), procedendo-se então à homogeneização da amostra por um período de 2 min.. A seguir, a mistura deverá ser mantida em repouso, sob temperatura ambiente, por 60±5 min. Misturar bem, procedendo-se a seguir à determinação do pH com o auxílio de uma tira de medição. Ajustar, se necessário, para o valor de 6,8 ± 0.2. Adicionar então 2,25 mL de Tergitol Aniônico 7 e misturar bem. Alternativamente pode-se utilizar Triton X-100.

2.2) Fase de Pré-Enriquecimento das amostras

Os sacos deverão ser transferidos para uma estufa bacteriológica e incubados por 24 ± 2 h at 35°C.

2.3) Fase de Enriquecimento Seletivo das amostras

Da mistura pré-enriquecida, deve-se transferir com o auxílio de uma pipeta automática, 0,1mL e 1mL para tubos contendo 10 mL do caldo Rappaport-Vassiliadis (RV) e 10 mL de caldo Tetrathionato, respectivamente.. O caldo RV deverá ser incubado por 24 ± 2 h at 42 ± 0.2°C e o caldo TT por 24 ± 2 h at 43 ± 0.2°C, ambos em banho-maria.

2.4) Fase de plaqueamento em meios seletivos

A partir dos caldos de enriquecimento seletivo, realizar estrias em placas com ágar Sulfito de Bismuto (BS), ágar Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD) e ágar Hektoen (HE), sendo as mesmas a seguir incubadas em estufa bacteriológica por 24 ± 2 h at 35°C. As placas de BS deverão ser preparadas no dia anterior à sua utilização e serem mantidas no escuro, sob temperatura ambiente.

Morfologia típica de colônias de Salmonella:

Ágar BS: colônias marrons ou pretas com ou sem brilho metálico. O meio ao redor das colônias muda gradativamente para uma coloração marrom a preta, com o prolongamento do tempo de incubação.

Ágar XLD: colônias cor de rosa escuro, com ou sem centro preto. Cepas fortemente produtoras de H2S podem produzir colônias com centro preto grande e brilhante, ou mesmo inteiramente pretas.

Ágar HE: colônias verde-azuladas, com ou sem centro preto. Cepas fortemente produtoras de H2S podem produzir colônias inteiramente pretas.

Obs: se colônias típicas estão presentes no ágar BS após 24 ± 2 h de incubação, toma-se então 2 ou mais delas para triagem bioquímica inicial em ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI) e ágar Lisina Ferro LIA). Independentemente ou não da presença dessas colônias típicas, as placas devem ser reincubadas por um período adicional de 24 ± 2 h. Após 48 ± 2 h de incubação, somente volte a tomar 2 ou mais colônias típicas se aquelas transferidas inicialmente para os ágars TSI e LIA tiverem produzido reação atípica nos mesmos, permitindo o seu descarte como não-Salmonella. Ver posteriormente a descrição das reações típicas de Salmonella nos ágars TSI e LI.A.

Morfologia de colônias atípicas de Salmonella:

Na ausência de colônias típicas ou suspeitas de Salmonella, procura-se por colônias atípicas, como as descritas a seguir:

Ágars HE e XLD: as salmonelas podem aparecer na forma de colônias amarelas, com ou sem centro negro Na ausência de colônias típicas após 24 ± 2 h de incubação, então tome 2 ou mais das atípicas para confirmação bioquímica posterior.

Agar BS: algumas cepas podem se apresentar na forma de colônias verdes com pouco ou nenhum escurecimento do meio adjacente. Na ausência de colônias típicas após 24 ± 2 h de incubação, reincube as placas por mais 24 ± 2 h adicionais. Se não houver colônias suspeitas após esse período, então tome duas ou mais colônias atípicas e transfira para tubos de TSI e LIA.

Nessa fase de plaqueamento seletivo devem ser utilizadas cepas padrões de Salmonella para evidenciamento de reações características e não características do patógeno nos três meios de cultura empregados.

- cepa controle com morfologia típica: Salmonella Typhimurium (ATCC 14028 ou de bacterioteca nacional)

- cepas controle com morfologia atípica: Salmonella diarizonae (ATCC 12325 ou de bacterioteca nacional) – lac (+) e H2S (+), Salmonella abortus equi (ATCC 9842 ou de bacterioteca nacional) – lac (-) e H2S (-)

2.5) Confirmação preliminar das colônias de Salmonella

É feita com as colônias típicas e atípicas de Salmonella isoladas nos ágars seletivos já citados. A transferência das colônias é feita com o auxílio de uma agulha de inoculação. Remove-se uma porção da massa de células do centro da colônia desejada e realiza-se a transferência para os ágars TSI e LIA. A inoculação deve ser feita por picada e estrias na rampa, utilizando-se a mesma alçada para inocular ambos os tubos. Não é necessário nem recomendável flambar a agulha e retirar outra porção da colônia, entre um tubo e outro. Os tubos de TSI e LIA devem ser incubados por 35°C for 24 ± 2 h.

Reação típica de Salmonella em TSI: rampa alcalina (vermelha) e fundo ácido (amarelo), com ou sem produção de H2S (escurecimento do ágar). Reação atípica em TSI, que não deve ser descartada se as demais reações em LIA se apresentarem típicas: rampa e fundo ácidos (amarelos), com ou sem produção de H2S (Fig. 1).

Reação típica de Salmonella em LIA: fundo e rampa alcalinos (púrpura, sem alteração daa cor do meio), com ou sem a produção de H2S (escurecimento do meio). Reação atípica em LIA, que não deve ser descartada se as demais reações em TSI se apresentarem típicas: fundo amarelado com rampa alcalina, com ou sem produção de H2S (Fig. 1) .

Observações:

1- se as placas de HE, BS ou XLD apresentarem colônias típicas, porém não isoladas de Salmonella, deve-se estriar uma alçada da colônia, tomada no centro e, se possível, sem tocar nas colônias adjacentes, estriar em placas de HE ou XLD, para purificação da cultura. Somente então, a partir da colônia pura, deve-se inocular os tubos de TSI e LIA.

2- os tubos de TSI devem ser inclinados com fundo de no mínimo 2,5 cm e incubados com a tampa ligeiramente afrouxada, para manter condições aeróbicas. Esse cuidado objetiva prevenir a excessiva produção de H2S e reações ácidas errôneas na rampa. Se, ainda assim, houver excessiva produção de H2S, mascarando a reação ácida do fundo, deve-se assumir a reação como típica.

3- os tubos de LIA devem ser inclinados com fundo de no mínimo 4,0 cm e incubados com tampa bem fechada, porque a reação de descarboxilação da lisina ocorre anaerobicamente. A exclusão do ar previne resultados falso positivos, resultantes da desaminação oxidativa das peptonas do meio de cultura.

Figura 1: tubos de TSI e LIA característicos

2.6) Testes sorológicos e bioquímicos para confirmação definitiva

Serão realizados os seguintes testes a partir das colônias puras:

- teste sorológico somático polivalente

- teste de urease

- teste de fermentação de dulcitol

- teste de indol

- teste de malonato

Serão consideradas como Salmonella todas as colônias que apresentarem as seguintes características:

- reações típicas em TSI e LIA

- teste sorológico somático polivalente (+)

- teste de urease (-)

- teste de fermentação do dulcitol (+)

- teste de indol (-)

- teste de malonato (-)

Culturas com uma ou mais reações atípicas devem ser submetidas a testes adicionais, relacionados a seguir:

- teste de fermentação da lactose e sacarose

- teste de vermelho de metila e Voges-Proskauer

- teste de citrato

- teste de descarboxilação da lisina em caldo

- teste sorológico flagelar polivalente