A Pratica de Microbiologia Aplicada

INSTITUTO FEDERAL GOIANO - Campus Rio Verde

GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA

MICROBIOLOGIA APLICADA

Profa Jéssika M. M. Ribeiro

ROTEIROS DE PRÁTICAS  

ROTEIRO I. ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DA ÁGUA DE CONSUMO

1. Locais de coleta:

Bebedouros da bovinocultura (um recém limpo e um sujo) e um destinado ao consumo humano.

1.1 Procedimento de coleta

Para a coleta das amostras de água, as torneiras devem ser lavadas com sabão, deixadas abertas de modo a permitir que a água corra por três minutos e, posteriormente, higienizadas com álcool 70%. Utilizar Frascos com capacidade para 200mL, previamente esterilizados por autoclavação a 121ºC por 15 minutos. Após a coleta, encaminhar imediatamente as amostras ao laboratório em caixas isotérmicas com gelo reciclável.

2. Determinação do NMP

A técnica do Número Mais Provável (NMP), também chamada de técnica dos tubos múltiplos, é bastante utilizada pelos laboratórios de microbiologia de alimentos para estimar a contagem de alguns tipos de microrganismos, como coliformes totais, coliformes termotolerantes (fecais), E.coli e Staphylococcus aureus.

2.1 Teste presuntivo para Coliformes Totais

Princípio: Inoculação da amostra em caldo lauril sulfato de sódio, onde a presença presuntiva de coliformes é evidenciada pela formação de gás nos tubos de Durham, produzido pela fermentação da lactose contida no meio. O caldo lauril sulfato de sódio apresenta em sua composição uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante impedindo a sua acidificação. A seletividade se deve à presença de lauril sulfato de sódio, um agente surfactante aniônico que atua na membrana plasmática de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento.

São preparadas séries de três tubos, contendo caldo Lauril Sulfato de Sódio (LST) em concentração dupla e simples.

A inoculação de cada amostra de água nas séries de três tubos obedece ao esquema abaixo:

                                                           AMOSTRA  

[pic 1]

* É feita a diluição prévia de 25mL de água em 225mL de diluente (salina peptonada 0,1%), diluição 10-1. A partir desta diluição, retira-se o inoculo de 1mL para a terceira série de tubos.

Os inóculos são incubados a 37ºC por 24 a 48 horas. A presença de coliformes totais é indicada pela formação de gases nos tubos Durhan (mínimo 1/10 do volume total) ou efervescência quando agitado gentilmente. Os tubos positivos em cada série devem ser anotados.

2.2 Teste Confirmativo

Repica-se através de alçada, a partir dos tubos positivos no caldo LST, para o caldo verde brilhante 2% lactose (BRILA). Os tubos são incubados a 37º C por 24 a 48 horas. Anotar o número de tubos positivos por série (diluição) e, reportar a tabela do número mais provável para séries de três tubos na proporção de amostra: 10, 1 e 0,1mL. Os resultados são expressos como NMP/ 100 ml

2.3 Determinação do NMP de Coliformes Termotolerantes (fecais)

Princípio: A confirmação da presença de coliformes fecais é feita através da inoculação em caldo EC com incubação em temperatura seletiva de 45°C ± 0,2ºC, a partir dos tubos positivos obtidos na prova presuntiva para coliformes totais. A presença de gás nos tubos de Durham evidencia a fermentação da lactose presente no meio. O caldo EC apresenta em sua composição uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante impedindo a sua acidificação. A seletividade se deve à presença de sais biliares responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos.

Repica-se através de alçada, a partir dos tubos positivos no caldo LST, para tubos com 5mL de caldo EC. Os tubos são incubados a 45º C por 24 a 48 horas em banho-maria com agitação.

A presença de coliformes termotolerantes é confirmado pela formação de gás nos tubos de Durhan ou efervescência quando agitado. Anotar o número de tubos positivos por série (diluição) e, reportar a tabela do número mais provável para séries de três tubos na proporção de amostra: 10, 1 e 0,1mL. Os resultados são expressos como NMP / 100 ml

        

2.4 Diferenciação de bactérias do grupo coliforme:

• Inocule por esgotamento, a partir de cada um dos tubos positivos com meio EC, em uma placa com meio BEM. Incube as placas invertidas por 24 horas a 37º C.
• Colônia típica de E. coli: nucleada com brilho metálico.
• Colônia atípica: anucleada, opaca, rosada e de consistência gomosa.
• Colete uma colônia de cada tipo da placa e faça uma coloração de Gram.

3. Contagem de bactérias heterotróficas

        Máximo permitido em água potável: 500 UFC/ml (Brasil, 2005).

Inoculação em profundidade de 1ml da amostra de água e, acrescentar 12 a 15 ml/placa de meio PCA. Inocular em duplicata, incubar as placas invertidas por 48 horas a 35-37º C. A contagem é expressa em UFC/ml da amostra.

4. Determinação de pH

Utilizar fita dosadora. O ph deve estar entre 6,0 e 9,5 para consumo humano de acordo com a Portaria 518 do MS (Brasil, 25/03/2004).

ROTEIRO II. AVALIAÇÃO DA QUALIDADE SANITÁRIA DE RAÇÕES ANIMAIS

1. Locais de coleta:

Depósito de ração da suinocultura e bovinocultura.

1.1 Procedimento de coleta

        Homogeneizar o saco de ração e coletar amostra de 200g em saco de papel. Fechar imediatamente e encaminhar ao laboratório.

2. Contagem de fungos filamentosos e leveduras

2.1 Preparo de meio de cultura

Preparar meio Agar Batata (BDA) de acordo com o fabricante, autoclavar a 121ºC por 15 minutos e verter em placas de Petri estéreis.

2.2 Diluição seriada da amostra