Tabela de orçamento

Funções do RNA Y na etapa de iniciação da replicação do DNA cromossômico de mamíferos

No que se sabe, a replicação do DNA é regulada, predominantemente, na ativação das origens, o que leva a formação das forquilhas de replicação durante a fase-S do ciclo celular.  Proteínas, na origem, (ORC, Cdc6, CDT1 e MCM2-MCM7), formam o complexo pré-replicativo. Proteínas quinases e ciclinas, convertem o complexo pré-replicativo na forquilha de replicação ativa que recruta a polimerase e fatores de replicação adicionais.

Replicação do DNA cromossômico, isento de células, é iniciada em molde de núcleos a partir de células em fase G1 com incubação em extratos a partir de qualquer forma assíncrona de células humanas proliferando ou de células sincronizadas em fase S. Através da técnica, recentemente foi identificado um pequeno RNA Y –não codificante como novo fator que são essenciais para a replicação do DNA cromossômico no núcleo isolado em G1.

Em seres humanos, quatro RNAs Y são expressos (Hy1, hY3, e hY4 hY5 RNA), e estão presentes nos extratos celulares solúveis usados em sistemas de replicação de DNA isento de células. A degradação específica de qualquer Hy1- hY3 RNA nestes extratos, resulta em uma inibição da replicação do DNA em núcleos em fase G1. A Re-addition de hY RNAs não degradado nega esta inibição da replicação do DNA, o que indica que os RNA Y são funcionalmente redundante neste sistema.

Os dados publicados no artigo (Christov et al, 2006;. Christov et al, 2008;.. Gardiner et al, 2009) são consistentes com a função do RNA Y na ativação das origens de replicação do DNA que levam à criação de novos forquilhas de replicação, o alongamento da cadeia no DNA na replicação de ADN progredindo a forquilha, ou uma combinação de ambos. Para discriminar entre estas possibilidades, utilizou-se a degradação de RNA Y e re-adição no sistema isento de células de mamífero e investigou-se as consequências sobre a replicação do DNA cromossómico por DNA combing e análise da cadeia nascente de DNA. Os resultados definem um ponto de execução mecanicista para a função de RNA Y no estabelecimento de novas forquilhas de replicação de DNA.

Resultados

O autor utilizou núcleo isolados de células em fase G1-S. As figuras 1A e 1B mostram a proporção dos núcleos em fase S com 16h e 24h e porcentagem de replicação por tempo de incubação dos núcleos de 16 e 24h, respectivamente.

Figura 1C: A degradação do RNA Y3 reduziu a proporção de replicação dos núcleos de 16 horas in vitro abaixo da proporção de núcleos em fase-S marcadas com BrdU. Esta inibição foi significativa (teste t: P = 0,0005). A adição de Hy1 RNA redundante foi inteiramente negada nesta inibição. Em contrapartida, nem degradação do RNA Y3 nem a suplementação com Hy1 RNA alterou significativamente a proporção de replicação dos núcleos em fase S sob estas condições.

Estes dados sugerem que os RNAs Y são necessárias para a iniciação da replicação do DNA em núcleos em fase G1. Eles sugerem a existência de que núcleos em fase S continuam a replicar DNA depois da degradação de RNA Y3 in vitro, mas a quantidade total de replicação de DNA nestes núcleos pode também ser sensíveis a degradação do RNA Y.

Com a técnica de molecular-combing, observou-se a criação de novas faixas de replicação em núcleos de 16h no fim da fase G1-depende Y RNA. Em núcleos de 24 horas, a degradação do RNA Y3 resultou numa redução de 2,5 vezes a densidade de replicação, que foi anulado após a adição de Hy1 RNA (Fig. 2C, painel da direita). Concluiu-se que a densidade de faixas de replicação é sensível à degradação de RNA Y3, não apenas em G1, mas também em núcleos em fase S.

Os resultados das fig. 2 e 3 estabelece dois pontos importantes sobre a replicação de DNA em núcleos em fase S in vitro. Em primeiro lugar, a iniciação de novas forquilhas de replicação in vitro não é restrita a fase G1, mas ocorre em núcleos em fase S bem. Vale a pena notar aqui que os núcleos em fase S de replicação in vitro, portanto, contêm uma mistura de forquilhas de replicação, ou seja, aqueles que tinham sido iniciadas in vivo antes da preparação dos núcleos e aqueles que estavam iniciada in vitro. Esta heterogeneidade mostra que os núcleos em fase S sintetizam DNA na ausência de fatores de iniciação, através do alongamento da cadeia à forquilhas pré-existentes (Krude, 2006) (Fig. 1) e, no topo deste, que iniciam novas forquilhas na presença de fatores de iniciação (Figuras 2 e 3). Em segundo lugar, RNAs Y não codificantes são necessários para a iniciação de novas forquilhas de replicação de DNA não apenas no G1 para transição da fase S, mas também durante as fases posteriores da fase S.

Conclui-se que a degradação de RNA Y inibe a iniciação de novas forquilhas de replicação em fase G1 tardia e em núcleos em fase S in vitro.

O alongamento da cadeia não depende de RNA Y

Com técnicas de molecar-combing, investigou se o esgotamento RNA Y tem qualquer efeito sobre o fase de alongamento da replicação de DNA.  Após alguns testes, concluíram que as taxas de progressão da forquilha de replicação não são afetados pela degradação do RNA Y3.

Eles concluíram ainda, que nem a o alongamento da cadeia de replicação do DNA cromossómico, nem a estabilidade da forquilha de replicação de DNA são dependentes Y RNAs.

RNAs Y são necessários para a síntese de cadeias de DNA nascente

Preparou-se cadeias de DNA nascentes e usou-se eletroforese em gel alcalino para determinar se RNAs Y são necessários para a síntese de cadeia nascente, ou para o alongamento da cadeia.

A incubação de extratos de núcleos em fase S, de 16 horas e de 24 horas, durante 15 minutos resultou na síntese de cadeias nascentes ao longo de um intervalo de grande a partir de uma centena de até vários milhares nucleótidos (Fig. 5A). Esse padrão não se alterou após um longo tempo de incubação; no entanto, DNA de elevado peso molecular se acumulou em pontos de tempo posteriores (Fig. 5a). Portanto, a síntese da cadeia nascente é iniciada assincronamente ao longo da reação in vitro em ambos núcleos em G1 em S.

Com a técnica de eletroforese em gel, tem-se que, a degradação Y3 RNA leva a uma redução global dos fios de DNA nascentes independente do seu tamanho, e não leva a uma acumulação de cadeias curtas. Concluímos, portanto, que o passo da iniciação da síntese da cadeia nascente, em vez do que a cadeia-alongamento, é inibida após degradação de RNA Y3, tanto em núcleos em fase G1 e em fase S, corroborando as conclusões a partir das experiências de DNA-combing.

Alongamento de cadeias de DNA nascentes não depende de Y RNAs